高效液相色谱法同时测定青蒿绿原酸、隐绿原酸、东莨菪内酯含量*

孙玉刚 ，秦续文 ，张 玲 ，李 晋 ，萧 伟 ，王振中 ，成志东 ，常艳旭 ，，3

（1.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室，天津 300193；2.江苏康缘药业股份有限公司博士后工作站，连云港 222001；3.天津中医药大学中医药研究院，中药化学与分析重点实验室，天津 300193）

青蒿为菊科植物黄花蒿（Artemisia annua L.）的干燥全草,具有清热解毒[1]、抗疟等功效[2]。青蒿药用历史悠久,在全国各地均有分布。研究表明青蒿素及其衍生物是青蒿抗疟的主要有效成分，并被研制成抗疟新药,是世界卫生组织（WHO）推荐的治疗疟疾的首选药物。同时，青蒿作为常用中草药，是临床有效中药热毒宁注射液的重要组成部分，在热毒宁注射液临床疗效起着重要的作用。

青蒿的化学成分种类较多,主要有黄酮类、香豆素、萜类、苯丙酸类和挥发油[3]。绿原酸、隐绿原酸作为热毒宁注射液有效成分[4]，在青蒿有分布[5]。香豆素成分可能是青蒿解热降温疗效的有效部位[6]，主要有东莨菪内酯、香豆素等。目前,青蒿中青蒿素、黄酮类和香豆素类成分均有含量测定的报道[7-9]，但是绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯同时测定方法未见报道。本实验首次建立了高效液相色谱法（HPLC）同时测定青蒿中绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯含量的方法，并对人工种植青蒿中以上3种成分含量进行测定，拟为青蒿药材的规范化种植及质量评价提供研究手段。

1 仪器与试剂

Waters 2695高效液相色谱仪,Waters 2487双波长检测器，Agilent Zorbax SB-C18反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。甲醇和乙腈为色谱纯（天津康科德科技有限公司），水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯等标准品购自成都曼斯特生物技术有限公司，经色谱法检测纯度在98%以上。6批青蒿样品采自江苏康缘药业股份有限公司东海县青蒿基地（2010年10月），自然晒干，含量测定前60℃下烘干12 h，粉碎后过100目筛，得粉末。

2 实验方法

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相:A 乙腈，B 0.1%甲酸水；梯度洗脱程序：0～6 min，9%～10%A；6～12 min，10%～11%A；12～25 min，11%～12%A；25～30 min，12%～13%A；30～35 min，13%～13%A；9%A 平衡5 min流速：1.0 mL/min；检测波长：325 nm；进样量：10 μL；柱温：35 ℃。

2.2 对照品溶液的制备 取绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯对照品适量，精密称定，加60%甲醇溶解并稀释，制成浓度分别为30.9、31.2、30.3 μg/mL混合对照品液。

2.3 供试品溶液的制备 取青蒿粉末0.30 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，加入60%甲醇定容至刻度，称质量，超声60 min，放冷，称定质量，用60%甲醇补足失质量，摇匀，14000 r/min离心10 min，取上清液，作为供试品溶液。

3 结果

3.1 色谱条件的优化 色谱条件考察时，选择乙腈-水作为流动相,结果发现样品的色谱峰分离度较差并且有一定拖尾现象。经多次实验后，最终确定以乙腈-0.1%甲酸溶液作为含量测定的流动相,采用梯度洗脱，所得色谱峰峰形尖锐,分离度高，见图1。

3.2 样品提取条件的优化 本研究采用了单因素分析方法，考察了超声波法制备供试品溶液条件,比较了不同提取时间（20、30、40、50、60、80 min）、不同提取溶液甲醇浓度（40%、60%、80%、100%）对绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯提取的影响,研究结果表明，3种有效成分随着超声时间的延长提取率变高，但在60 min时3种有效成分含量较高；而随着甲醇浓度的升高，有效成分的提取率呈先上升后下降的趋势，60%甲醇提取效果最好，因此，最后确定以60%甲醇超声提取60 min为最佳提取条件。

3.3 方法学考察

3.3.1 线性范围、标准曲线、定量限、检测限 精密称取绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯对照品适量,配制一系列不同浓度的对照品溶液,分别进样10 μL，按上述色谱条件测定其峰面积各个化合物的峰面积。以化合物进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯标准曲线分别为Y赞=19 327X+u="1（r=0.9999）、Y赞=10 063X-339.2（r＝0..2（＝）、Y赞=17 606X-7606（r＝0.9999），线性范围分别为 0.515～30.900、0.520～31.200、0.501～30.300 μg/mL，检测限分别为 0.103、0.104、0.202 μg/mL，定量限分别为 0.31、0.32、0.60 μg/mL。

3.3.2 精密度实验 取同一供试品溶液，连续进样6次，测定其浓度，计算它们的相对标准偏差。绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯RSD分别为0.8%、1.7%和1.5%，表明该系统进样精密度良好。

3.3.3 重复性实验 取同一批样品,制备供试品溶液6份，测定其浓度,计算它们的相对标准偏差。绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯RSD分别为2.8%、2.9%和2.8%，表明方法重复性好。

3.3.4 稳定性实验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24 h 进样，测定其浓度，计算其相对标准偏差。绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯RSD分别为2.7%、2.8%和2.8%，表明样品溶液在24h内稳定。

3.3.5 加样回收率 取已知含量的青蒿样品粉末6份，每份约0.15 g，精密称定，分别加入适量绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯对照品，供试品溶液制备方法制备，并依法测定。计算回收率，结果表明绿原酸的平均回收率为100%，RSD为1.9%，隐绿原酸的平均回收率为102%，RSD为2.5%，东莨菪内酯的平均回收率为99.7%，RSD为2.7%，说明绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯的提取和检测方法可行。

以上青蒿有效成分定量方法学考察结果表明，该方法精密度、重复性、回收率结果均较好，能够准确、快速地测定青蒿药材中绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯3种成分的含量。

3.4 样品测定 分别吸取对照品溶液和6批人工种植青蒿的供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪,按上述色谱条件测定,并计算绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯的含量。结果见表1，可知人工种植青蒿绿原酸含量在（0.532±0.185）mg/g，隐绿原酸含量在（0.119±0.016）mg/g，东莨菪内酯在（0.78±0.09）mg/g，人工种植青蒿有效成分相对比较稳定。

4 讨论

本实验建立了高效液相色谱法同时测定青蒿中绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯含量的方法，并对其进行了方法学考察。结果显示该方法准确度高，专属性强、灵敏度及稳定性均较好，测定结果能客观准确地反映青蒿药材中绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯的含量。

表1 人工种植青蒿绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯含量测定结果Tab.1 Result of chlorogenic acid,cryptochlorogenic acid and scopoletin content of cultivated A.Annua L mg/g

测定结果表明，人工种植青蒿中东莨菪内酯含量最高，绿原酸次之，隐绿原酸最低。青蒿中绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯是热毒宁注射液中重要的药效成分，对其含量测定方法的研究，有利于从原材料对热毒宁注射液进行质量控制。

本实验对人工种植青蒿中的绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯3种有效成分进行了测定,今后还将对种植密度和环境条件对青蒿中3种有效成分含量的影响和不同生育期变化规律做进一步研究,为青蒿规范化种植提供科学依据。

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