生物素亲和素系统在ECP的实验效能

赵俊芳 王学谦 李桂珍

嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（eosinophilia cationic protein，ECP）是一种相对分子质量为21 ku的碱性蛋白，存在于嗜酸性粒细胞（eosinophil，EOS）颗粒的基质部分。其作为EOS的活性标记，已被广泛应用于变态反应疾病的诊断、治疗和疗效判定中。生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于生物素、亲和素均可与蛋白质、核酸、多糖和酶等生物活性物质结合，同时还能与固相材料结合，减少反应中的空间位阻，故其在ELISA中得到广泛应用。本研究将BAS应用于ECP的检测，评估其对实验效能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器 辣根过氧化物酶（HRP）购自美国GE公司，二甲基酰胺（DMF）、N-羟基琥珀酰亚胺生物素（NHS-d-生物素）、亲和素（13 g/L）购自Sigma公司；ECP抗原（Ag）0.1 g/L、抗ECP单克隆抗体（mAb）0.25 g/L购自芬兰Hytest公司；抗ECP多克隆抗体（pAb）购自沃克生物科技公司，由免疫动物制备；ECP双抗体夹心法酶联免疫检测试剂盒（美国ADL公司），96孔酶标反应板（美国Costar公司），酶标分析仪（DNM－9602，北京普朗新技术有限公司）；洗板机（EL×50，美国 BioTek Instruments公司）。

1.2 方法

1.2.1 HRP标记抗ECPpAb 纯化的抗ECPpAb经改良过碘酸钠法标记HRP，经方阵实验确定其应用浓度为1∶8 000，-86℃保存，常规应用于-20℃保存[1]。

1.2.2 抗ECP mAb纯化 用ECP亲和层析柱纯化抗ECP mAb[2]，经非变性SDS-PAGE电泳发现其在83～175 kb之间有清晰条带，无其他杂带，在还原性SDS-PAGE电泳中，有2条清晰条带。经紫外分光光度计检测其抗体浓度为0.96 g/L。

1.2.3 抗-ECPmAb的生物素化 取1 mL纯化抗ECPmAb，经0.1 mol/L碳酸盐（pH 9.5）溶液透析后得到抗体600μL，其在280 nm处的吸光度（A280）为2.512。在抗体中加入3μL 20 g/L DMF溶解的生物素溶液，室温反应1 h。将该液体滤过经pH7.4 PBS/proclin溶液平衡的Sephadex G25（柱长12 cm，内径1.1 cm，流速800μL/min），收集第1个洗脱峰，共得液体2 mL，该液体为生物素化的抗ECPmAb，4℃保存[3]。继续用pH7.4 PBS/proclin溶液洗柱，出现第2个洗脱峰（为游离生物素），洗至基线后，用储存液继续洗脱凝胶柱。

1.2.4 生物素化牛血清白蛋白（BSA） 将0.3 g BSA溶解于30 mL pH 9.5的碳酸盐（0.1 mol/L）溶液中，充分搅拌30 min。将0.1 g NHS-d-生物素溶解于3 mLDMF中，充分搅拌溶解。将2种溶液混合，室温搅拌反应1 h，过0.22μm滤膜。将所得液体滤过Sephadex G25柱（柱体积为250 mL，流速3 mL/min）。接收第1个洗脱峰，所得液体为生物素化的BSA（biotinylation of BSA，BBC）,体积为64 mL，终浓度约为5 g/L。

1.2.5 建立直接包被抗体的检测法 将1∶500稀释的抗ECPmAb 150μL室温过夜包被，洗涤后加入200μL封闭液，37℃封闭2 h，洗涤，加样品稀释液稀释的ECP标准品及待测血清，50μL/孔，再加入酶稀释液1∶8 000稀释的酶标抗人ECPpAb100μL/孔，37℃水浴1 h。洗涤后加入底物A、B，避光室温反应15 min后加入终止液。30 min内以450 nm为检测波长，630 nm为参考波长，读取吸光度。

1.2.6 建立先包被生物素的检测法 1∶1 500稀释BBC 150 μL包被过夜，洗涤后再包被1次。洗涤后加入150μL 375倍稀释的亲和素，室温2 h，洗涤，加入封闭液200μL，37℃烤箱放置2 h。洗板3次后，每孔加入150μL稀释（1∶1 200）的生物素化单抗，室温放置2 h。检测过程同1.2.5。

1.2.7 建立先包被亲和素的检测法 用1∶300稀释的亲和素150μL包板，室温过夜，洗涤后加入封闭液200μL，37℃烤箱放置2 h。洗涤，每孔加入150μL稀释（1∶1 200）的生物素化单抗，室温放置2 h。检测过程同1.2.5。

1.2.8 标准曲线的确立 将ECP抗原稀释为0、2.5、5、10、20、50、100、200、500和1 000 μg/L的浓度，作标准曲线。

1.2.9 试验效能评价 （1）灵敏度：对浓度为标准曲线最低值进行10次重复测试，其平均值加2倍标准差为检测方法的灵敏度。（2）不准确度：检测高值（38μg/L），低值（8μg/L）标本，每个测试做2次，取平均值，用相对偏差（Bias%）来表示测定结果的不准确度。（3）重复性：对高值（38μg/L），低值（8 μg/L）标本重复测定10次，计算其批内和批间变异系数（CV）。（4）稳定性：将3种方法的试剂盒放置37℃烘箱于3、4、6、12 d取出，与4℃放置试剂盒测定同一批标本，比较其稳定性。

1.2.10 临床血清标本的检测 选取2009年1月—2010年5月我院收治的过敏性皮肤病患者380例（患者组）和正常体检者56例（对照组），均静脉取血3 mL，室温下放置60 min后，1 000 r/min离心15 min，血清放-20℃冰箱保存。用本研究制备的3种检测试剂盒以及美国ADL双抗夹心检测试剂盒同时检测ECP水平。

1.3 统计学处理 应用SPSS10.0软件对数据进行分析，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3种方法的线性范围比较 3种方法的线性都较好，先包被生物素的检测法和先包被亲和素的检测法的线性范围较宽，见表1。

Table1 Comparison of linear rangebetween threemethods表1 3种方法线性范围比较

2.2 3种方法的变异度、灵敏度和不准确度比较 3种方法的变异系数差异无统计学意义（F=0.16，P>0.05）；重复性都较好，灵敏度、不准确度相近，见表2。

Table2 Comparison of variation,sensibility and inaccuracy between three methods表2 3种方法的变异度、灵敏度和不准确度比较

2.3 稳定性比较 先包被亲和素的检测法最为稳定，试剂盒在37℃条件下放置12 d，与4℃放置试剂盒对比差异均无统计学意义（t=0.811，P>0.05）；直接包被抗体的检测法次之，试剂盒在37℃放置12 d，与4℃放置试剂盒对比差异有统计学意义（t=4.98，P<0.05），先包被生物素的检测法最不稳定，试剂盒在37℃放置4、6和12 d，与4℃放置试剂盒对比差异均有统计学意义（t分别为2.76、3.59、8.21，均P<0.05），见表3。

Table 3 Resultsof ELISA stability between threemethods表3 3种方法的试剂盒稳定性结果 （μg/L，±s）

Table 3 Resultsof ELISA stability between threemethods表3 3种方法的试剂盒稳定性结果 （μg/L，±s）

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2.4 临床标本检测结果 4种方法之间比较差异无统计学意义（P>0.05），见表4。

Table4 Comparison of levelsof eosinophilia cationic protein usingfour methodsin patient group and control group表4 4种方法检测患者组与对照组ECP水平比较（μg/L，±s）

Table4 Comparison of levelsof eosinophilia cationic protein usingfour methodsin patient group and control group表4 4种方法检测患者组与对照组ECP水平比较（μg/L，±s）

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3 讨论

近年来研究表明，血ECP水平与过敏性疾病的发生发展密切相关，ECP是疾病诊断、病情监测的较好指标[4]。目前用于检测ECP的商品试剂盒均为国外进口，具有操作简便、快捷的优点，但价格都比较昂贵，故研制性价比高的国产ECP酶联免疫检测试剂盒具有重要意义。

生物素亲和素技术是近几年来发展很迅速的一门生物学技术。其原理基于生物素与亲和素的以下特征:（1）二者具有高度特异的亲和性。（2）桥联作用。（3）多级放大作用。BAS在酶促反应中的作用是通过生物素亲和素将免疫复合物与酶连接起来，形成放大酶免法。由于生物素亲和素技术的多级放大作用，该法较免疫扩散法和ELISA法具有更高的灵敏度。生物素亲和素也可预包被在酶标板孔内，然后再将生物素化Ab（或Ag）包被于孔内，从而解决了一些Ab（或Ag）不易包被的难题，也提高了检测灵敏度。汪进等[5]在检测HBsAg的ELISA法中，采用链霉亲合素预包被和Ab直接包被的酶标板进行比较，前者灵敏度可达0.15μg/L，后者为2 μg/L，而且前者在37℃下至少可保存3周。

本研究中，笔者先将生物素化BSA与酶标板结合，然后加入亲和素，再加入生物素化的抗ECP mAb，这样可大大提高抗体的结合量，提高实验的灵敏度，增加线性范围，同时可以节省一半以上的抗体，因为这种包被法不仅可增加固相载体上的抗体包被量，而且使其结合位点充分暴露，有利于免疫反应的有效进行[6]。先包被亲和素，再加入生物素化的抗ECPpAb，也可增加线性范围，且在本研究中，该法的稳定性是最好的。本研究中，BBC包被后的试剂盒稳定性稍差，可能是因为自己制备的BBC不够稳定。就操作烦琐程度而言，生物素包被法最为烦琐，抗体包被法最简单。但是先包被生物素或亲和素，封闭后再包被抗体，抗体包被时间只需2 h，且不需要再封闭，这在实际的检测试剂盒制备中可以节省时间。

本研究通过抗ECPmAb的纯化、生物素化及抗ECPpAb的酶标、多种实验条件的优化，制备了较为良好的ECP酶联免疫检测试剂盒。同时，通过对3种检测方法的比较，发现生物素亲和素系统可提高实验的敏感度，节约抗体包被时间，并可节省包被抗体的用量，为ELISA试济盒的制备提供又一思路。

[1]沈关心.现代免疫学技术[M].第2版.武汉：湖北科学技术出版社，2002：1511-152．

[2]舒晓宏,李传刚,张海涛,等.抗核糖酸酶抵制因子抗体的制备[J].细胞与分子免疫学杂志,2004,20(5):572-574.

[3]Mao SY.Biotinylation of antibodies[J].Methods Mol Biol,1999,115:39-41.

[4]Kato M,Yamada Y,Maruyama K,etal.Serum eosinophil cationic protein and 27 cytokines/chemokines in acuteexacerbation of child⁃hood asthma[J].Int Arch Allergy Immunol,2010,152(Suppl 1):62-66.

[5]汪进,罗伟.链霉亲和素-生物素-ELISA方法的建立及其在HB⁃SAg测定中的应用[J].上海检验医学杂志,1998,13(4):213-214.

[6]Chiu ML,Tseng TT,Monbouquette HG.A convenient homogeneous enzyme immunoassay for estradiol detection[J].Biotechnol Appl Biochem，2011,58(1):75-82.