血管紧张素原基因M235T多态性与结直肠癌易感性关系的研究

侯 波

（吉林省人民医院 急诊外科，吉林 长春130021）

血管紧张素原（angiotensinogen，AGT）作为肾素－血管紧张素系统中的第一步限速反应的底物，不仅在调节血压和稳定体液平衡方面发挥着极为重要的作用，而且能够抑制肿瘤细胞增殖、迁移和肿瘤血管的形成［1］。位于AGT基因第2外显子的T→C错义突变导致编码产物第235号氨基酸的转变：甲硫氨酸（Met）→苏氨酸（Thr）。以往多项研究调查了AGT基因M235T多态性与多种肿瘤易感性的关系［2－6］。然而，其与中国人群结直肠癌的相关性尚未见报道。本研究采用病例－对照研究分析了AGT基因M235T多态性与中国人群结直肠癌的相关性，旨在寻求新的结直肠癌分子遗传学标记物，为揭示其发病机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选自入住我院普外科结直肠癌患者151例，男性90例，女性61例，平均年龄59.7（±13.4）岁。所有病例均经组织病理学确诊，其中高中分化87例，低分化64例；临床Ⅰ－Ⅱ期86例，临床Ⅲ－Ⅳ期65例；有远处转移87例，无转移64例。对照组选自我院健康体检中心，共202例，男性128例，女性74例，平均年龄57.3（±11.5）岁，无肿瘤家族史，各项体检指标均正常。所有入选对象均为无血缘关系汉族个体。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及引物合成 采集入选对象者外周静脉血3ml，按照北京百泰克生物科技公司全血基因组DNA提取试剂盒操作说明提取DNA。参照文献［7］设计引物，上游引物：5’－CAGGGTGC TGTCCACACTGGACCCC－3’，下游引物：5’－CCGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT－3’。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2.2 PCR扩增 PCR 反应体系为25μl，含10×反应缓冲液3.0μl，dNTP 2.5μl，MgCl21.5μl，上、下游引物各0.25μl，TaqDNA 聚合酶1.0U，基因组DNA 1.5μl，用无菌去离子水补足至25μl。

在PCR扩增仪（Eppendorf 5331，德国）上按以下条件进行循环反应：94℃预变性4min；94℃变性30s，67℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环；末次循环后72℃延伸10min。

1.2.3 限制性内切酶酶切PCR扩增产物 取PCR扩增产物3μl，用限制性内切酶TthIII I（NEB公司，美国）酶切。65℃孵育4小时，反应终止后，酶切产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，以DNA MarkerI作为标准参照物分析判读结果。

1.3 统计学方法

直接计数法计算结直肠癌组和对照组AGT M235T基因型和等位基因频率，Hardy－Weinberg遗传平衡定律用于检测基因型的遗传平衡状态，各组间比较采用χ2检验，比值比（OR）及其95%可信区间（CI）用于估计相对危险度。所有数据均运用SPSS19.0统计软件包处理，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

PCR扩增片段大小为165bp，经限制性内切酶TthIII I酶切后呈现以下三种情况：MM基因型（165bp一条带）；MT基因型（165bp、141bp和24 bp三条带）；TT基因型（141bp和24bp两条带）。

结直肠癌组与对照组AGT M235T基因型和等位基因频率分布见表1，两组基因型频率均符合Hardy－Weinberg平衡（P＞0.05），表明入选对象具有较好的群体代表性。结直肠癌组AGT M235T基因型（TT、MT和MM）和等位基因（T和M）构成比与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

根据临床病理特征进行分层分析，发现TT基因型在高中分化和低分化结直肠癌患者中分布差异具有统计学意义（χ2＝6.95，P＝0.008），比值比（95%CI）为2.50（1.26－4.97）；未发现 AGT M235T多态性与结直肠癌临床分期和转移状态之间存在明显相关性（P＞0.05）（见表2）。

表1 结直肠癌组与对照组AGT M235T多态性分布

表2 AGT M235T多态性与结直肠癌临床病理特征相关性

3 讨论

结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，尽管其发病机制尚未完全阐明，但已经证实其发生发展是多因素长期共同作用的结果，其中肥胖被认为是结直肠癌的一个重要危险因素［8］。血管紧张素原（angiotensinogen，AGT）主要在肝脏合成，肝外主要来源于脂肪组织；脂肪组织中过表达AGT mRNA能够造成血浆AGT含量明显增高，同时造成脂肪堆积，最终引起肥胖［9］。在小鼠动物模型中，AGT基因缺陷能够部分阻止由于饮食引起的肥胖［10］。由此推测，肥胖相关基因（AGT）与结直肠癌的发病具有一定的相关性。

本研究采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性方法探讨了中国人群AGT基因M235T多态性与结直肠癌易感性的关系，虽然未发现该多态性在病例组和对照组中存在明显相关性，但是分层分析发现低分化结直肠癌患者中TT基因型频率明显高于高中分化结直肠癌患者，携带TT基因型个体患低分化结直肠癌的风险比携带MT／MM基因型高2.50倍，表明携带TT基因型的结直肠癌患者更容易呈现低分化状态和更高的恶性程度。

该研究结果与文献报道一致，Vasku等调查了捷克人群中AGT M235T多态性与结直肠癌发病风险的关系（102例结直肠患者和101例非结直肠癌个体），发现AGT M235T多态性在病例组和对照组中分布无差异，并且与临床分期无关［6］。遗憾的是，该研究未进一步分析该多态性与结直肠癌分化状态的相关性。关于AGT M235T多态性与其他肿瘤易感性的关系，目前，文献报道结果并不一致。Gonzalez－Zuloeta等报道AGT M235T多态性 M等位基因增加了荷兰绝经后妇女乳腺癌的发病风险［5］。然而，Mendizabal－Ruiz等报道AGT M235T多态性与墨西哥妇女乳腺癌的发病无关［4］。此外，有报道AGT M235T多态性与口腔癌、胃癌的发病无关［2，3］。不能排除这种差异是由于种族差异引起的，因此，有必要进行多中心、多种族、大样本的协同研究以明确AGT M235T多态性与肿瘤的相关性。

综上所述，本研究发现AGT M235T多态性与中国人群结直肠癌的分化程度密切相关，携带TT基因型的结直肠癌患者更容易呈现低分化病理状态。更大样本量的重复验证性研究有望为结直肠癌的风险预测、个体化用药和临床有效防治提供新的线索。

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