老龄大鼠铜绿假单胞菌肺部感染模型建立及炎症反应研究

文婕 殷少军

铜绿假单胞菌(PA)属条件致病菌，好发于免疫力低下者，为院内感染的重要病原菌之一[1-2]。老年特别是高龄患者抵抗力减弱，免疫功能低下，呼吸道防御能力削弱，多有基础疾病和诱发因素，极易发生PA肺炎，且发病后缺乏特异性临床表现，病死率高，临床诊治存在诸多困难。鉴于人类在体研究的局限性，建立合适的动物模型仍是进行本病研究及筛选治疗方案的重要手段。

尽管文献中有关PA肺部感染的动物模型不少，但这些模型均是不同学者根据自己的研究领域和研究目的制作的，无论是动物种类、年龄、致病菌菌量还是接种方法等均不相同，很难比较、取舍。为了建立自己的急性老龄PA肺部感染动物模型，我们在借鉴前人经验的基础上设计了本实验。拟探讨本建模方案的可行性，并通过观察其病程和病理生理变化，探讨该模型的应用价值，以期为后续的深入研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠60只，鼠龄20～22月，体质量700～900 g，由北京维通利华公司提供，统一编号并按照动物使用条例A-75-10-01进行饲养和实验。

1.2 菌株来源 PA标准菌株ATCC27853，由复旦大学附属中山医院临床微生物实验中心提供。35℃MH琼脂平板培养24 h，采用麦氏管目测和分光光度仪比色法(波长550 nm，吸光度0.5)，用灭菌蒸馏水配成两个麦氏单位浓度(6×108cfu/ml)，国内外PA诱导动物肺炎模型大多采用此细菌浓度[3-4]。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及建模:将全部大鼠随机分为实验组和对照组，每组30只，从中各取20只分别按气管接种PA后2 h、6 h、9 h、12 h、24 h 分为5 个亚组，每亚组4 只。实验组大鼠采用3%戊巴比妥钠(30mg/kg)行腹腔麻醉后，仰卧，固定于动物手术台，抬高鼠板头端，与操作台面成30°角，减去颈部体毛，用0.5%络合碘消毒术野，置于超净工作台，随后于颈前正中纵向切开皮肤及皮下组织并向两侧牵开，逐层分离至暴露气管，在直视下，用一枚头皮针穿刺两软骨环之间，保持针头与气道方向一致，用1 ml无菌注射器取新鲜配置的PA菌液0.2 ml，自头皮针管缓慢注入，接种后立即拔出针头，竖立鼠板，保持大鼠直立体位30 s，并轻轻晃动头部，以确保菌液均匀分布至两侧肺部随后缝合处理颈部切口，置头稍高位。对照组大鼠用等体积灭菌生理盐水(NS)取代PA菌液，余处理同上。另取剩余大鼠(20只)同上建模，用于观察气管接种PA后生存率和生存时间。

1.3.2 标本采取与处理:按分组于不同预定时间点对实验动物进行标本采集与处理:(1)心脏采血，麻醉固定同前，0.5%络合碘消毒颈部和全胸，置于超净工作台，先解剖左侧胸壁至肋间肌，见到心脏搏动后，用无菌注射器在心脏取血，置于10 ml真空采血管，4℃保存送检，并处死大鼠;(2)解剖开胸，观察双肺肉眼改变，取右肺下叶部分组织送细菌学培养及菌落计数，取右肺心叶10%福尔马林固定，送病理学检查。

1.4 病原学诊断 取约5 mm×5 mm×5 mm的肺组织块无菌操作下以研磨器研磨成肺组织匀浆，并置于血琼脂培养基中37℃培养，24 h后观察计数。肺炎模型的成功建立依赖于细菌学指标(肺组织匀浆菌落计数)和组织病理学检查。建模标准，参照Pearson等[5]定义，稍作改动:急性期:(1)肺组织含菌量为 ＞105cfu/g，(2)病理组织学检查，病理学改变包括:肺组织水肿、纤维蛋白渗出、中性粒细胞浸润;慢性期:(1)肺组织含菌量为＞103cfu/g，(2)病理组织学检查，病理学改变包括肺组织实变、纤维增生、淋巴细胞浸润。

1.5 观察指标 (1)一般情况:观察各组大鼠接种后毛色、活动、呼吸、精神状态、摄食等一般情况改变;(2)死亡率及死亡时间;(3)全血白细胞分类计数:采用CELL DYN3700全自动血细胞分析仪兽类检测模式[6];(4)肺组织大体改变:开胸后，肉眼直视观察;(5)肺组织病理学改变:以10%福尔马林固定右肺心叶组织，常规酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后连续切片，HE染色后光镜下观察肺组织病理变化。

1.6 统计学方法 实验数据以均数±标准差表示，所有数据采用SPSS 10.0软件统计。组间比较采用t检验，P＜0.05表示具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 2组大鼠均于接种后半小时内开始出现呼吸急促，搔鼻次数增多，偶有呛咳。其中，对照组大鼠的表现于2 h内明显，2～6 h趋于平缓，6 h以后活动增多，呼吸道反应逐渐减弱，毛发较整齐，至9～12 h接近术前水平，主动多次进食、饮水，反应较灵敏。实验组大鼠的表现进行性加重，呛咳明显，搔鼻增多，呼吸道症状于12～16 h趋于平缓，但至24 h仍未恢复接种前水平，全过程均呈现毛发凌乱，无光泽，精神萎靡，反应迟钝，活动量及进食量较对照组明显减少。

2.2 死亡率比较 观察7 d，对照组大鼠无一死亡，实验组大鼠4只死亡，分别死于接种后10 h、12 h、18 h、32 h。实验组死亡率(40%)明显高于对照组(P＜0.05)。

2.3 肺组织细菌学结果 接种后2 h、6 h、9 h、12 h、24 h，对照组大鼠肺组织均未培养出PA，实验组大鼠肺组织均培养出PA，差异有统计学意义(P＜0.01)。且随时间延长，实验组大鼠肺组织细菌负荷量呈下降趋势，至24 h达最低，见表1。

2.4 外周血白细胞计数 接种后，对照组大鼠，外周血白细胞、多形核白细胞(PMN)未见明显异常。实验组大鼠，外周血白细胞计数呈先增后降趋势，于12 h达高峰，随后缓慢下降，至24 h仍稍高于对照组，见表2。

表1 2组大鼠气管接种PA/NS前后肺组织细菌负荷动态变化(珋，×105 cfu/ml肺匀浆，n=30)

表1 2组大鼠气管接种PA/NS前后肺组织细菌负荷动态变化(珋，×105 cfu/ml肺匀浆，n=30)

注:与对照组比较，＊＊P＜0.01

组别2 h 6 h 9 h 12 h 24 h实验组 2.39±0.39＊＊ 1.95±0.49＊＊ 1.31±0.17＊＊ 1.20±0.22＊＊ 0.58±0.23＊＊对照组00000

表2 2组大鼠气管接种PA/NS前后外周血白细胞动态变化(珋，×109/L，n=30)

表2 2组大鼠气管接种PA/NS前后外周血白细胞动态变化(珋，×109/L，n=30)

注:与对照组比较，*P＜0.05

项目 实验组 对照组2 h 白细胞总数 3.43±0.15*3.20±0.31 PMN 1.03±0.54 0.80±0.26 6 h 白细胞总数 4.65±2.56* 2.80±0.22 PMN 2.13±1.26 1.00±0.15 9 h 白细胞总数 6.48±1.46* 2.80±0.27 PMN 2.80±1.41* 0.70±0.11 12 h 白细胞总数 9.20±1.36* 2.50±0.15 PMN 5.30±1.74* 0.80±0.28 24 h 白细胞总数 3.67±1.32* 2.50±0.58 PMN 1.43±0.12*0.60±0.42

2.5 肺组织病理学检查 接种前，2组大鼠肺组织肉眼观及镜下表现均未见异常，接种后:(1)标本大体观察:对照组大鼠双侧肺叶无明显异常，实验组大鼠肺组织(上叶及下叶为主)有不同程度水肿、出血、纤维化(斑块)，9～24 h明显。(2)镜下观察:对照组气管接种NS后2～6 h，镜下改变较局限，可见轻微水肿、出血，及少量炎症细胞聚集，其他各阶段均未见明显异常;实验组大鼠气管接种PA后，镜下改变弥散，且随时间进展，PMN、单核巨噬细胞聚集增多，肺组织结构破坏严重，水肿、出血多见，这些改变以6～24 h明显，12～24 h达高峰(见图1)。

图1 肺组织病理学检查(HE，×400)

3 讨论

当前细菌性肺炎占人类各类病原体肺炎的80%。PA属条件致病菌，长期应用激素、免疫抑制剂、肿瘤化疗、放射治疗等导致病人免疫功能低下，以及手术后及某些治疗操作后(气管切开，保留导尿管等)的病人易罹患本菌感染，故亦为医院内感染的重要病原菌之一[7-8]。老年特别是高龄患者，由于特殊生理原因，更易发生PA肺炎。因此建立老年PA肺部感染的动物模型，并探索其动物模型的诊断标准及观测指标，对临床处理老年PA肺炎有重要价值。

为能模拟临床免疫功能降低病人感染PA后的炎症反应及其特点，国内学者李倬哲等[3]于2001年成功建立粒细胞减少大鼠PA肺炎动物模型。该模型，采用糖皮质激素联合环磷酰胺共同作用造成大鼠免疫功能下降、粒细胞减少。在此基础上，适宜浓度的PA菌液经气管接种大鼠，以模拟临床上常见的粒细胞缺少患者的肺部感染。此外，也有部分学者根据自己研究领域和研究目的不同，建立专门针对老龄动物的肺部细菌感染模型[9-10]，但鉴于研究目的不同，在实验动物选择、年龄、接种剂量及接种方式上各不相同，各种方法之间，难以比较取舍。本实验在借鉴前人经验的基础上，结合整体实验研究目的，采用前述方法建立自己的急性老龄PA肺炎动物模型，在探讨建模方法可行性的同时，以期为老龄PA肺炎动物模型的建立提供新的思路。

同时，考虑到本课题组主要研究方向，为能与青年动物模型间进行良好比较，进而在此基础上探索比较青年PA与老年PA肺炎患者在病理生理、生化等各方面的改变，为老龄PA肺炎的深入研究和探索更为合理有效的治疗手段奠定基础。因此，在接种剂量的选择上，我们并未进行剂量梯度实验，而是选用了目前国内外诱导青年大鼠PA肺部感染模型的常用剂量，以探讨该剂量诱导老龄动物模型的可行性。所以，本实验的不足之处在于无法进行不同建模剂量之间的横向比较，以提供更好的选择，关于该问题，我们会在后续实验中不断完善。

另外，为使所建动物模型与临床急性老龄PA肺炎的肺部炎症发病过程，病理变化和细菌指标更为接近，本实验在菌种选择、无菌手术操作方面严格遵循相关原则。实验结果参照Pearson等[5]定义建模标准，结合本实验细菌学(肺组织匀浆菌落计数)和组织病理学研究数据，以及相关辅助数据，表明:应用经气管切开法接种PA标准菌液(ATCC27853，6×108cfu/ml，0.2 ml)可成功建立老年大鼠急性PA肺部感染模型，为临床研究和控制老年急性PA肺部感染提供了基础资料，具有重要参考价值。有关老龄大鼠PA肺部感染相关炎性因子表达及其机制尚待进一步研究。

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