蛛网膜下腔出血后早期海马ADAMTS-1的表达与血脑屏障通透性的相关性研究

籍新潮 朱继 吕国伟 万伟峰 徐睿

蛛网膜下腔出血 （subarachnoid hemorrhage，SAH）后的早期脑损伤（early brain injury，EBI）是近几年人们提出的一个新的研究方向，并认为其可能是SAH患者病死率较高的重要原因，其中细胞外基质的降解是EBI的重要组成部分。ADAMTS－1是一种新发现的金属蛋白酶，可通过降解细胞外基质参与多种病理生理过程，目前研究发现其与神经系统疾病的发生有密切关系［1］。本研究拟通过检测实验性大鼠SAH后ADAMTS⁃1的表达与血脑屏障通透性的改变，初步探讨其在SAH后EBI中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象 健康成年雄性SD大鼠108只，体质量250～300 g。由重庆医科大学实验动物中心提供。大鼠随机分为假手术组（sham）组和SAH组，Sham组共18只，其中6只用于检测ADAMTS⁃1蛋白水平，6只用于检测ADAMTS⁃1 mRNA表达，6只用于血脑屏障检测，前期实验已证实sham组各时间点中ADAMTS⁃1的表达无统计学差异，故均于术后72 h处死。SAH组（90只）根据处理时间分为 6、12、24、48、72 h 5 个亚组，每亚组各 18 只大鼠，其中每组6只用于检测ADAMTS⁃1蛋白水平，6只用于检测 ADAMTS⁃1 mRNA表达，6只用于血脑屏障检测。Anti⁃ADAMTS⁃1、 伊文氏蓝（Evans blue，EB）均购于美国 Santa公司，Trizol试剂盒、RT⁃PCR检测试剂盒购自Takara公司。

1.2 SAH模型的制作 据文献采用改良的视交叉前池注血法建立大鼠SAH模型［2］，SAH组从股动脉插管抽取自体动脉血300 μL，经PE10导管在30 s内缓慢注入蛛网膜下腔。Sham组动物按同样方法向蛛网膜下腔注入等量生理盐水。

1.3 ADAMTS-1的 mRNA 的检测 ADAMTS⁃1 mRNA的检测按Trizol试剂盒说明提取海马组织总RNA。紫外分光光度法测定RNA的含量，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。采用两步法RT⁃PCR试剂盒配置反应体系。ADAMTS⁃1及GAPDH引物由Takara公司设计并合成。ADAMTS⁃1的 Left Primer：5′⁃GATAAGTGTGGCGTTTGTGGAG⁃3′，Right Primer：5′⁃GATGGTCAGGGGTTCTTTGAGT⁃3′，扩增片断为336 bp。 内 参 GAPDH 的 Left Primer：5′⁃GTGCT⁃GAGTATGTCGTGGAGTCT⁃3′，Right Primer：5′⁃GT GGAAGAATGGGAGTTGCTGT⁃3′，扩增片段 610 bp。RT⁃PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下拍照，采用quantity⁃one图像处理系统分析比较电泳条带相对光密度值。

1.4 大鼠海马组织ADAMTS-1的 Western-Blotting分析 取大鼠海马组织100 mg，裂解、离心、定量。提取含30 μg蛋白的样品进行SDS⁃PAGE凝胶电泳。然后转印至硝酸纤维膜，浸入封闭液中（37℃，2 h）。加入一抗并4℃冰箱孵育过夜，以TBST洗膜3次，每次10～15 min；加入辣根过氧化物酶标记驴抗羊IgG （二抗），摇床上37℃孵育90 min，以TBST洗膜3次，加入新鲜配制的底物反应液，轻摇至显色后，去离子水漂洗终止显色。成像后由 quantity⁃one软件系统计算 ADAMTS⁃1和β⁃actin的光密度值，二者比值作为该样品ADAMTS⁃1蛋白的表达量。

1.5 脑伊文氏蓝含量的检测 每组大鼠处死前经10%水合氯醛麻醉，后经股静脉注射2%EB（5 mL／kg），60 min后向左心室灌注37℃生理盐水，待流出液清亮后迅速断头取脑，分开右大脑半球，去除皮质表面的蛛网膜、血凝块及脑室脉络丛，置于已知体积甲酰胺中，测定脑体积。继续加甲酰胺至脑体积的5倍，置37℃恒温水浴箱中，48 h后离心取上清液，紫外分光光度计波长632 nm比色测定OD值，根据标准曲线计算脑组织EB含量（mg／g脑湿重）。

1.6 统计学分析 运用SPSS 13.0处理，多组间均数的比较采用单因素方差分析，用LSD⁃t检验比较两两之间的差异，变量之间采用pearson相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠海马组织ADAMTS-1mRNA表达变化SAH后6 h、12 h组大鼠海马组织ADAMTS⁃1mRNA表达与sham组比较无明显差异 （6 h P=0.381，12 h P=0.263）；SAH 后 24 h 大鼠海马组织 ADAMTS⁃1 mRNA表达开始增高（与sham组相比，P=0.011）；SAH后48 h海马ADAMTS⁃1mRNA表达达到高峰（与 sham 组 相 比 ，P=0.004）；SAH 后 72 h ADAMTS⁃1mRNA活性较SAH后48 h开始下降，但仍高于Sham组水平（和Sham组相比P=0.017）。见图 1、表 1。

2.2 大鼠海马组织ADAMTS-1蛋白表达水平变化SAH后6 h、12 h组大鼠海马组织ADAMTS⁃1蛋白表达与sham组比较无统计学意义（6 h P=0.461，12 h P=0.537）；SAH后 24 h大鼠海马组织ADAMTS⁃1蛋白表达显著增高 （与sham组相比，P=0.024）；SAH 后 48 h 海马 ADAMTS⁃1 蛋白表达达到高峰（与 sham 组相比，P ＝ 0.007）；SAH 后 72 h ADAMTS-1蛋白活性较SAH后48 h开始下降但仍然维持在较高水平（与Sham组相比P＝0.019）。见图 2、表 1。

2.3 SAH后大鼠血脑屏障通透性改变 与Sham组比较，SAH后6 h及12 h大鼠脑内EB含量无明显差异（6 h P ＝ 0.504，12 h P ＝ 0.436）； SAH 后 24 h大鼠脑内 EB含量显著增加（P＝0.024）；SAH 后48 h及72 h大鼠脑内EB含量仍较高，与Sham组相比有明显差异（48 h P ＝ 0.017，72 h P ＝ 0.031）。见表1。

图1 RT-PCR显示Sham组及SAH后各时间点大鼠海马组织ADAMTS-1mRNA的表达及相应的GAPDH对照。

图2 Western-blotting显示sham组及SAH后各时间点大鼠海马组织ADAMTS-1表达及相应的β-actin对照。1：sham组；2：SAH后6 h 组；3：SAH 后 12 h 组；4：SAH 后 24 h 组；5：SAH 后 48 h 组；6：SAH 后 72 h组

表1 大鼠海马组织ADAMTS-1蛋白、mRNA的表达和脑内EB的含量

2.4 大鼠海马ADAMTS-1蛋白表达与脑内 EB含量的相关性 SAH后6 h、12 h及Sham组大鼠海马组织ADAMTS-1蛋白表达与脑内EB含量不相关，分别为（r1＝ 0.307，P ＝ 0.238；r2＝ 0.312； P ＝0.267；r3＝0.418，P＝0.114），SAH 后 24 h、48 h、72 h两者呈正相关，分别为（r4＝ 0.932，P＝0.021；r5＝0.951，P＝0.016； r6＝ 0.904，P＝ 0.027），SAH后ADAMTS-1蛋白表达与脑内EB含量整体呈正相关（r＝0.936，P＝0.014）。

3 讨论

自发性SAH是具有高病死率和高病残率的临床常见病，主要病因为颅内动脉瘤破裂（约占80%）［3］。过去研究主要集中在再出血和脑血管痉挛及其相关并发症上。想从这一途径来降低死亡率，但是迄今仍没有形成有效的治疗方案来预防和减轻SAH后的脑损伤。近几年，人们提出了一个新的研究方向，早期脑损伤（EBI）［4］并认为是SAH患者死亡的重要原因，其指的是从初次出血那刻起到迟发性血管痉挛发生之前脑组织内发生的一系列改变［5］。在EBI中有许多机制的改变，包括ICP升高、脑血流量（cerebral blood flow，CBF） 减少、脑灌注压（cerebral perfusion pressure，CPP）降低、血管收缩、血管腔内阻塞等，这些均可造成微循环障碍，而海马区神经元对缺血具有选择性敏感，所以海马成为脑损伤研究的一个典型脑区［6］。血脑屏障（BBB）的破坏是EBI的重要组成部分，其早期功能障碍促进了脑水肿的发生［7］。而导致BBB破坏的诸多因素中细胞外基质的损伤尤为重要［8］。蛋白聚糖（PG）是细胞外基质的基本骨架，在维持血脑屏障的完整性中起重要作用。ADAMTS-1是一种新发现的金属蛋白酶，属于分泌型蛋白，ADAMTS-1分泌后大多通过C末端3个TSP重复序列和间隔区锚定在细胞外基质中［9－11］。ADAMTS-1 可以通过降解细胞外基质蛋白［12－13］，如Versican、Brevican、Aggrecan，参与多种生理和病理生理过程。Cross AK等［14］研究显示早期脑梗死时ADAMTS-1表达上调，并可能参与破坏BBB的完整性。

本研究采用改良的视交叉前池注血法建立大鼠SAH模型，应用Western-Blotting和RT-PCR方法检测大鼠海马ADAMTS-1蛋白及mRNA表达变化，同时应用甲酰胺浸泡法检测大鼠脑内EB含量以观察血脑屏障的变化。结果发现大鼠SAH后24 h海马ADAMTS-1蛋白及mRNA含量明显升高，48 h达到高峰，并于72 h开始下降但仍高于sham组水平。研究同时观察到从SAH后12 h到72 h大鼠血脑屏障通透性增高。大鼠脑内EB含量自SAH后24 h开始升高，72 h仍维持在较高水平，SAH后48 h大鼠脑内EB含量最高，SAH后早期大鼠脑内EB含量与ADAMTS-1蛋白活性呈正相关，提示SAH后大鼠血脑屏障损害可能与ADAMTS-1降解细胞外基质，导致血脑屏障结构破坏有关。

本研究显示细胞外基质相关蛋白ADAMTS-1与SAH后BBB的损害有关，可能在SAH后EBI中发挥重要作用。本实验还发现SAH后72 h ADAMTS-1活性仍维持在较高水平。因为ADAMTS是最近才被发现的一组酶，有关其生理及病理意义的认识尚有一定的局限，ADAMTS-1在细胞外基质降解致BBB损害中的作用程度有待进一步研究，但可以确定的是，作为其特异性的底物硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）［15－16］，在脑中存在的主要类型有 Aggrecan，neurocan，versican，brevican，其通过CS链抑制神经损伤修复中轴突再生的作用机制已较为明确［17－20］，所以 ADAMTS-1 可能在SAH后的EBI及神经损伤后的修复两个过程中均发挥了一定的作用。随着其功能的日渐明了及其在EBI中的深入研究，ADAMTS-1将有可能成为SAH治疗的新的靶点。

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