三聚氰胺DNA适体的筛选研究

张 强

三聚氰胺DNA适体的筛选研究

张 强

为了筛选识别三聚氰胺的DNA适体，于体外合成ssDNA文库并固相化于琼脂糖凝胶颗粒表面，将液相中三聚氰胺将与其结合的DNA分子从固相表面分离，进而建立非固相化SELEX技术，最终获得了三聚氰胺识别适体，并采用DNAMAN和RNA Structure软件对适体进行了一、二级结构分析。结果显示，经过10轮筛选，ssDNA文库与三聚氰胺的亲和力呈上升趋势，随机挑选的20个阳性克隆适体根据一级结构的同源性可分为4个家族，二级结构预测以茎环结构为主，表明筛选得到识别三聚氰胺的DNA适体。

三聚氰胺；适体；食品安全；检测技术

小分子污染物问题已经成为世界各国普遍关注的食品安全问题之一，近年来频发的三聚氰胺食品安全事件让人们意识到了此类问题的严重性，更使人们意识到发展针对小分子污染物的新型检测技术的重要性[1]。基于核酸适体(一种新型分子识别元件)的检测技术近年来发展迅速[2-3]。但是，核酸适体检测技术才在食品安全领域刚刚起步，目前还没有关于三聚氰胺核酸适体筛选和应用的报道。本研究旨在采用小分子非固相化SELEX技术，筛选识别三聚氰胺的DNA适体，为三聚氰胺适体检测技术的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 DNA序列

研究中所使用的DNA序列如表1所示，均由上海英骏生物技术有限公司合成。

表1 研究中使用的DNA序列

注：Library两端是引物结合区，中间用来固定适体库。N10和N20表示ssDNA库的随机区。

1.2 试剂与仪器

Thermo链霉亲和素凝胶：南京生兴公司；TaqMix：东盛生物公司；TA克隆试剂盒：北京康为世纪生物有限公司；DNA Marker：东盛生物公司；Trans 10感受态细胞：北京全式金生物技术有限公司；三聚氰胺标准品：Augsburg公司；Sartorius；高速冷冻离心机：Thermo；微量紫外可见分光光度计：GE Helthcare；LB940多功能微孔板分析仪：德国Berthold；Costar 3915黑色96孔板：美国Costar公司；JS-680D全自动凝胶成像分析仪：上海培清科技有限公司。

1.3 SELEX筛选

(1)随机适体库的固定 第一轮：将2.0nmol ssDNA文库、10.0nmol B-B以及2.5nmol P1和P2溶于200μl SB溶液(300mmol/L NaCl，50mmol/L KCl，10mmol/L MgCl2，50mmol/L Tris，pH8.3)后，90℃变性3min，4℃孵育过夜；第二轮及以后：根据实际投入ssDNA的量，按照ssDNA∶P1∶P2∶B-B为1∶1.5∶1.5∶5溶于200μl SB后，90℃变性3min，室温退火30min。取200μl链亲和素修饰的琼脂糖凝胶于离心柱中，用SB洗涤5次，加入孵育过夜的溶液，在旋转混合器上作用40min，然后将凝胶与液相离心分离。

(2)三聚氰胺洗脱特异性结合的ssDNA SB洗涤上述固定好的凝胶10次。用200μl 0.5mmol/L的三聚氰胺与固定好的ssDNA文库在旋转混合器上室温孵育40min，然后将凝胶与液相离心分离，液相中的ssDNA即为筛选的目标ssDNA。

(3)PCR扩增 利用2×TaqMix进行PCR扩增，扩增时上、下游引物分别为F-P3和P2-B，每轮对引物的添加量、模板的添加量和循环轮数进行优化，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。

(4)dsDNA的拆分 将PCR扩增得到的dsDNA与链霉亲和素标记的凝胶孵育，加入NaOH 200μl，在混合器上室温孵育15min，使dsDNA碱变性解链，然后600g离心1min，收集滤液。

1.4 TA克隆与测序

按照北京康为世纪生物有限公司的TA克隆试剂盒的使用说明进行，随机挑选20个阳性克隆，送上海英骏生物技术有限公司进行测序鉴定。

1.5 序列分析及二级结构预测

采用DNAMAN软件对筛选到的ssDNA进行一级结构序列比对，采用RNA structure软件对ssDNA进行二级结构分析。

2 结果与分析

2.1 每轮适体筛选的效率

图1 每轮筛选的效率

本研究进行了10轮的适体筛选，每轮的筛选效率如图1所示。从图1可以看出，在第2轮筛选时的筛选效率仅仅1.5%，随着筛选轮数的增加，洗脱的ssDNA在逐步富集，筛选效率逐步增加；但在第10轮筛选时，筛选效率几乎不再增加，此时筛选效率达到70.4%。

2.2 克隆测序及一级结构

将第10轮的洗脱产物PCR扩增后，利用试剂盒参照说明书进行TA克隆。随机挑取20个阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司进行测序鉴定(表2)。经DNAMAN软件分析，20个ssDNA序列分为4个家族(SS1、SS2、SS3、SS4)。

表2 筛选到的ssDNA序列

2.3 二级结构

采用RNA structure软件对SS1、SS2、SS3和SS4二级结构进行了分析(图2)，可以看出，这4条序列的二级结构主要以茎环结构为主。SS1形成双茎环，环中均含有1个“GTT”序列；SS2形成“Y“字结构，其中长茎连接环及共同形成环中含有1个“GTT”序列；SS3和SS4中均含有1个茎环结构，并且环中各有1个“GTT”序列；这些茎环可能是适体与三聚氰胺结合的结构基础，茎环结构中的茎可能起到稳定结构的作用，环则直接与靶分子结合，具体的结合位点还不清楚。

图2 ssDNA的二级结构

3 讨论

传统的针对小分子物质适体筛选的SELEX技术，通常采用固相化小分子的策略，对小分子的分子结构具有一定要求，且筛选效果很难达到预期目的。本研究针对三聚氰胺核酸适体进行筛选时，借鉴Nutiu等[4]报道的非固相化小分子的适体SELEX筛选策略，并将Nutiu等使用的放射性标记的方法进行改进，采用荧光标记的上游引物进行PCR扩增，PCR产物经过拆分获得的次级库是带有荧光标记的ssDNA，这样就通过荧光检测非常简便地监控筛选过程，避免了放射性的操作，并且可以通过比较筛选时投入和洗脱的ssDNA的荧光强度来估算适体筛选的效率。这种非固相化小分子的适体筛选策略省了小分子改造固定的过程，大大提高了适体的筛选效率，并且有可能同时筛选到针对单个靶分子的特异性适体和针对多个靶分子的广谱型核酸适体。

[1]Ingelfinger J R.Melamine and the global implications of food contamination [J].The New England and Journal of Medicine,2008,359:2745-2748.

[2]Tombelli S,Mascini M.Aptamers biosensors for pharmaceutical compounds [J].Combinatorial Chemistry & High Throughput Screenin,2010,13:641-649.

[3]Weigand J E,Suess B.Aptamers and riboswitches:perspectives in biotechnology [J].Applied Microbiology and Biotechnology,2009,85:229-36.

[4]Nutiu R,Li Y.Invitroselection of structure-switching signaling aptamers [J].Angewandte Chemie,2005,117:1085-1089.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.07.013

R155

A

1673-1409(2012)07-S047-03

2012-07-02

中国博士后科学基金(20090451177)；江苏省博士后科研资助项目(0802023B)。

张 强(1979-)，男，山东济南人，博士，助理研究员，研究方向营养与食品卫生学。

刘贤金，E-mail:jaasliu@jaas.ac.cn。