补肾促排卵颗粒剂对高雄激素所致抑孕小鼠促排卵的影响*

杜汴兴，于喜乐

(1．中国平煤神马医疗集团总医院，河南 平顶山467000;2．河南中医学院第一附属医院，河南 郑州450000)

不孕不育的治疗是维持生殖健康的一个重要方面。排卵障碍性不孕的比例约占不孕症的20%～25%。引起排卵障碍性不孕的原因主要有中枢神经性无排卵、下丘脑性无排卵、垂体性无排卵、卵巢性无排卵、多囊卵巢综合征和卵巢黄素化不破裂综合征等。对于本病的研究，无论是中医学还是现代医学，均取得了一定的进展。目前现代医学治疗排卵障碍性不孕的方法主要是服用促排卵药物，但其产生的副作用越来越受到人们的关注。中医药的治疗具有廉、便、效、验的特点，且有较少毒副作用。本课题是以笔者多年临床经验总结而出的肾—子宫生理生殖轴理论为指导，通过观察补肾促排卵颗粒剂对高雄激素所致的抑孕小鼠促排卵的影响，探讨其作用机制，从而为临床运用提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 动 物

昆明种雌性小鼠，20 日龄，体质量18～22 g，由郑州大学动物实验中心提供，合格证号:SCKX(豫)2005－0001。

1．2 药品、试剂与仪器

补肾促排卵颗粒剂由丹参、合欢皮、熟地黄、茺蔚子、川牛膝、川续断、五灵脂、红花等药物组成，由河南中医学院第三附属医院颗粒剂药房提供，为广东一方制药有限公司产品。将颗粒剂用蒸馏水溶解，4 ℃冰箱保存备用。枸椽酸氯米芬胶囊，上海衡山药业有限公司产品，批号H31021107，用时将胶囊内容物制成混悬液;丙酸睾丸酮注射液，上海通用药业股份有限公司产品，批号090302。SP9003 免疫组化试剂盒，由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，批号40480459。妇科内分泌酶联免疫测定药盒(批号31180013)及仪器(Access 型号)，由美国Beekman－coulter 公司提供。DF110 型电子分析天平，北京赛多利斯天平有限公司产品;LDZ－52 型低速自动平衡离心机，北京医用离心机厂产品;BX60 型Olypus 显微摄影系统，产地日本。

1．3 动物分组与模型的建立

将小鼠按体质量随机分层分为6 组，每组16 只。正常对照组16 只，颈背皮下注射生理盐水;余下80 只造模，参照俞瑾［1］的颈背皮下注射丙酸睾丸酮的方法:将80 只小鼠颈背皮下注射0．06 mL 丙酸睾丸酮，每4 d 1 次，连续注射2 周，停药1 周。将造模后的小鼠随机分为模型对照组、枸椽酸氯米芬胶囊组和补肾促排卵颗粒剂大、中、小剂量组。均分笼喂养，每组2 笼，自然光照，室温17～20 ℃，湿度50%～70%，喂以颗粒饲料，自由饮水。

1．4 给药方法

补肾促排卵颗粒剂大、中、小剂量组依次给以8．33，4．11，2．08 g/kg 补肾促排卵颗粒剂颗粒混悬液，枸椽酸氯米芬胶囊组给以16．67 μg/g 枸椽酸氯米芬胶囊混悬液，分别按小鼠体质量(0．02 mL/g)、组别灌胃给药，每日1 次。正常对照组、模型对照组按体质量给以等容积生理盐水。连用4 周后，停药48 h，每组处死8 只，另余8 只做受孕率实验。因部分标本组织处理不当，故各组测试样品数量不同。

1．5 检测指标

1．5．1 血清雌二醇(E2)

停止灌胃48 h，小鼠眼眶取血，分离血清，酶联免疫法检测E2(送检)。

1．5．2 卵巢、子宫脏器指数

处死小鼠，剖开腹腔，切取子宫和卵巢，剥离周围脂肪组织，迅速以扭力天平称湿质量，并按公式计算脏器系数。脏器系数=脏器质量/体质量×100。1．5．3 卵巢组织形态学

卵巢取出后，经100 g 甲醛固定，组织切片经HE 染色及油红O 染色处理后，在普通光学显微镜下观察。

1．5．4 雌激素受体(ER)

采用免疫组化法检测。子宫取出后，经100 g/L甲醛固定，组织切片石蜡包埋，4 μm 切片，雌激素受体标记，苏木素复染后光镜观察。

1．5．5 各组小鼠用药后雌雄合笼受孕情况

将每笼8 只小鼠内放入2 只正常成熟雄性小鼠，合笼10 d 后，解剖子宫，观察其受孕情况。

1．6 统计学方法

采用SPSS 13．0 统计分析软件处理。计量资料数据以均数()± 标准差(s)表示，组间比较采用t检验，以P＜0．05 为差别有统计学意义。

2 结 果

2．1 各组小鼠卵巢指数、子宫指数对比

与模型对照组对比，补肾促排卵颗粒剂大、中剂量组的卵巢指数和大、中剂量组的子宫指数增加，差别有统计学意义(P＜0．05 或P＜0．01);而补肾促排卵颗粒剂小剂量组、枸椽酸氯米芬胶囊组与模型对照组比较，子宫指数差别无统计学意义(P＞0．05)。见表1。

表1 各组小鼠卵巢指数、子宫指数对比 x－ ±s

2．2 各组小鼠血清中E2 含量对比

模型对照组E2含量与正常对照组对比，差别有统计学意义(P＜0．05)。用药后枸椽酸氯米芬胶囊组与模型对照组对比，差别有统计学意义(P＜0．05);补肾促排卵颗粒剂大、中剂量与模型对照组对比，差别有统计学意义(P＜0．01);但补肾促排卵颗粒剂小剂量组，差别无统计学意义(P＞0．05)。说明补肾促排卵颗粒剂大、中剂量对造模小鼠的雌激素水平有使其恢复正常的作用，且程度接近枸椽酸氯米芬胶囊组。见表2。

表2 各组小鼠血清中E2 含量对比 ±s

表2 各组小鼠血清中E2 含量对比 ±s

注:与正常对照组对比，* P ＜0．05;与模型对照组对比，# P ＜0．05，## P ＜0．01。

组 别 动物数 E2/(μg·L －1)9．83 ±2．86模型对照组 7 6．29 ±1．80*枸椽酸氯米芬胶囊组 6 13．50 ±5．08#补肾促排卵颗粒剂大剂量组 7 15．75 ±2．94##补肾促排卵颗粒剂中剂量组 6 17．50 ±4．02#补肾促排卵颗粒剂小剂量组正常对照组6 8．83 ±2．86 6

2．3 各组小鼠卵泡数量、卵细胞数量、间质腺成分及ER 表达率对比

镜下观察结果显示:模型对照组可见大量原始窦状卵泡，卵细胞结构不清，卵泡直径小，内含大量浆液性物质，生长卵泡数目较少，黄体数量少。正常对照组可见各期卵泡及黄体组织。补肾促排卵颗粒剂大、中、小剂量组均可使卵巢的黄体数量增加，间质腺发达，促进卵泡的发育、排卵及黄体生成。其中补肾促排卵颗粒剂大、中、小剂量组接近于正常组，而枸椽酸氯米芬胶囊组没有发现黄体，间质腺成分比例明显低于补肾促排卵颗粒各组。

补肾促排卵颗粒剂大、中、小剂量组卵细胞数、卵泡数量与模型对照组对比，差别均有统计学意义(P＜0．05)，与正常对照组接近。而ER 表达率补肾促排卵颗粒剂大、中、小剂量组、枸椽酸氯米芬胶囊组与模型对照组比较，差别均有统计学意义(P＜0．05)。见表3。

从本实验可以看出:造模对间质的影响不明显，枸椽酸氯米芬胶囊组用药后对间质腺体的影响不大，而补肾促排卵颗粒剂大、中、小剂量组的实验动物用药后间质腺体的水平高于正常对照组。这也从一个侧面说明:补肾促排卵颗粒剂是通过整体调节生殖器官的功能发挥作用，而不是单一对卵泡的刺激。

表3 各组小鼠卵泡数量、卵细胞数量、间质腺成分及ER 表达率对比 ±s

表3 各组小鼠卵泡数量、卵细胞数量、间质腺成分及ER 表达率对比 ±s

注:与正常对照组对比，* P ＜0．05，＊＊ P ＜0．01;与模型对照组对比，# P ＜0．01。

组 别 动物数 卵泡数量/个 卵细胞数量/个 间质腺成分 ER 表达率/%正常对照组12．5 ±2．0 12．5 ±2．0 25．00 ±7．01 34．17 ±5．34模型对照组 6 9．2 ±2．1 2．4 ±0．7 45．00 ±9．88 60．00 ±9．13＊＊枸椽酸氯米芬胶囊组 6 34．3 ±5．9## 6．2 ±1．6# 21．67 ±4．80 11．17 ±3．44##补肾促排卵颗粒剂大剂量组 6 28．4 ±3．6## 5．4 ±1．4## 31．67 ±1．00* 33．30 ±5．04##补肾促排卵颗粒剂中剂量组 6 21．7 ±3．8## 5．1 ±1．1## 45．83 ±6．52* 16．00 ±6．06#补肾促排卵颗粒剂小剂量组 6 23．2 ±2．6## 5．4 ±1．3## 36．76 ±5．53* 29．60 ±3．77 6#

2．4 各组小鼠受孕情况对比

补肾促排卵颗粒剂大剂量组的妊娠率与枸椽酸氯米芬胶囊组、正常对照组相当，说明补肾促排卵颗粒剂大剂量组与枸椽酸氯米芬胶囊组一样可以恢复造模实验动物的生理功能。见表4。

表4 各组小鼠受孕情况对比

3 讨 论

中医学认为:肾藏精，为天癸之源，司生殖，精卵藏之于肾，所以肾为生殖之本。现代医学认为:卵子生成于卵巢，卵泡卵子是卵巢的主要组成部分，卵泡的发育、卵子的成熟、排卵的顺利，均有赖于雌激素水平不断提高［2］。因此，雌激素与卵泡、卵子的关系类乎于肾阴、癸水、与精的密切关系，即中医学的肾－天癸－冲任－胞宫与下丘脑－垂体－卵巢环路相应。故本实验用以补肾活血通络为原则组方的促排卵颗粒剂调节卵巢功能，促发排卵实验，从而为中医药治疗排卵功能障碍性不孕症提供新思路。

3．1 补肾促排卵颗粒对子宫、卵巢的影响

本研究显示:补肾促排卵颗粒剂使实验动物卵巢、子宫质量增加，并增加卵丘及卵泡、黄体的数量，使间质腺发达，促进卵泡的发育，且大剂量组和中剂量组作用明显。补肾促排卵颗粒剂大、中、小剂量组卵细胞数、卵泡数与模型对照组对比，差别有统计学意义，与正常对照组接近。对E2的影响:补肾促排卵颗粒剂可以提高模型对照组小鼠血中的E2水平，其作用机制可能是通过调整性腺轴的功能，从而促使造模动物恢复排卵功能。从此实验看，补肾促排卵颗粒剂大剂量组的效果要优于小剂量组。

3．2 补肾促排卵颗粒对实验动物子宫内膜ER 的影响

补肾促排卵颗粒剂大、中、小剂量组、枸椽酸氯米芬胶囊组的ER 表达率与模型对照组对比，差别有统计学意义，且中药组均优于枸椽酸氯米芬胶囊组。雌激素受体是雌激素发挥作用的桥梁。如果E2水平低，会导致ER 合成障碍。子宫内膜的功能也可以反映受精卵着床的情况，排卵前雌激素水平作为孕激素参与胚泡着床是不可少的。只有腺上皮ER 在围着床期下降、滋养细胞侵入子宫内膜才能使孕激素支持着床，也只有当腺上皮ER、PR 表达量明显降低，内膜处于可容受状态，才是胚胎着床的最佳时机。由于子宫内膜的功能也可以反映受精卵着床的情况，其中生殖器官的发育依赖于激素的作用，子宫是雌激素的靶器官，雌激素能增进子宫血液的运行，促进其平滑肌细胞增生、肥大。雌激素的生理作用是由雌激素受体介导的拼体激素对子宫靶器官的效应。雌激素的生物学效应应取决于雌激素水平ER 的含量，以ER 数为指标可以判定药物的激素活性。

3．3 展 望

人工辅助生殖技术的发展对促排卵治疗提出了更高的要求。随着对排卵机制和卵巢周期调节机制的深入了解，促排卵方法在不断地改进，可仍有许多不尽人意之处，如可出现卵巢过度刺激症候群、卵巢反应不良、多胎妊娠、自然流产、乳腺癌、子宫内膜癌等［3－6］。传统的中医药的安全性与有效性，在治疗排卵障碍性不孕症得到了医者的重视，同时在辅助生殖技术的前后使用中医药进行调理，也使其成功率得到提高。在治疗方面，众多有关补肾药的研究表明:补肾中药具有明显的调经和促排卵作用，其强度可增加50%～100%，可提高排卵细胞质量和卵裂能力，且是以增加正常卵细胞和卵裂细胞为主，对卵细胞质量和卵裂过程不产生异常影响［7］。本研究从雌激素水平、雌激素受体、卵巢组织形态学角度，证明了补肾促排卵颗粒剂对下丘脑－垂体－卵巢轴的功能的影响，对临床上运用该方治疗排卵障碍性不孕提供了实验依据，作出了有意义的探索。在今后的工作与研究中可从分子生物学、药物指纹学等多学科探讨中医药治疗排卵障碍性不孕症的机制，更好地发挥中医药在治疗该病中的优势。

［1］孙斐，俞瑾．中药天癸方对雄激素致不孕人鼠Leptin 受体及神经肽YmNRA 的影响［J］．中国中西医结合杂志，2000，20(5):362．

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［3］高永良，曾真，朴泰虎，等．卵巢过度刺激综合征［J］．国外医学:妇产科分册，1988，3:142．

［4］邓高王．中西医妇科新理论新技术［M］．北京:人民军医出版社，2002:130．

［5］Rossing MA，Daling JR，Weiss NS，et．aI．In situ and invasive cervical carcinomain a cohort of inefrtile women［J］．Fertil Steril，1996，65(1):19－22．

［6］Fuller PN．Malignant melanoma of the ovary and exposure to no clomiphene citrate:a case report and review of the literature results［J］．Am J Obstet Gynecol，1999，180(6 Pt 1):1499－1503．

［7］张树成，沈明秀，蔡连香，等．补肾调经和养血补肾方药调经促排卵作用的实验研究［J］．中医杂志1999，40(6):369－371．