细菌菌株MS1的铅锌抗性和吸附性能研究

吴方猛， 何怀东， 颜君岚， 杨丹菁， 靖元孝*

(1. 华南师范大学生命科学学院，广东省高等学校生态与环境科学重点实验室，广东广州 510631;2. 广州市环境保护科学研究院，广东广州 510620)

细菌菌株MS1的铅锌抗性和吸附性能研究

吴方猛1， 何怀东1， 颜君岚1， 杨丹菁2， 靖元孝1*

(1. 华南师范大学生命科学学院，广东省高等学校生态与环境科学重点实验室，广东广州 510631;2. 广州市环境保护科学研究院，广东广州 510620)

从广东凡口铅锌尾矿分离到1株重金属抗性细菌菌株MS1，该菌株对Pb2+和Zn2+的最大耐受浓度分别为4、40 mmol/L.菌株MS1能在17～37 ℃和pH 3～13条件下生长，最适生长温度和pH分别为27 ℃和7.菌株MS1对高渗透环境有较强的适应性，最适生长盐度为4%.当Pb2+和Zn2+浓度分别为2、10 mmol/L时，60 h内菌株MS1对Pb2+和Zn2+的最大吸附量和最大吸附率分别为13.9、20.0 mg/g和23.3%、25.2%.菌株MS1对Zn2+的吸附能力大于对Pb2+的吸附能力.

Zn2+; Pb2+; 重金属抗性; 细菌; 吸附作用

近年来，各种工业(如采矿、冶炼、电镀等)废水和固体废弃物的渗出液直接排入水体，致使水体含有较高含量的重金属.在长期受到重金属污染的环境中必然会存在大量的能适应重金属污染环境并且对重金属具有较强抗性的微生物类群.重金属不能被微生物降解，但是微生物可以吸附、转化和溶出重金属[1].水体重金属污染的修复方法通常采用物理和化学方法，如化学沉淀法、离子交换法、膜分离法等.近年来，水体重金属污染的微生物修复成为研究的热点，其中微生物吸附法受到了广泛关注[2-4].曹小红等[3]从重金属污染土壤中分离筛选到2株耐受和吸附Pb的细菌菌株G和Y，菌株G和Y的冻干菌体对Pb的吸附量分别为126.42、61.08 mg/g，湿菌体对Pb的吸附率分别为94.66%和99.74%.张汉波等[4]从铅锌矿分离到的细菌菌株CS13，Pb2+和Zn2+对其最小抑制浓度分别为32、8 mmol/L，冻干菌体对Pb和Zn的吸附量平均达到了400、80 mg/g.本实验从广东凡口铅锌尾矿分离筛选重金属抗性细菌，并研究其重金属吸附能力，为水体重金属污染的微生物修复提供参考.

1 材料和方法

1.1 培养基和试剂

牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，琼脂 18 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.4±0.2，液体培养基不加琼脂.

重金属溶液：Pb2+和Zn2+溶液分别用ZnSO4·7H2O和Pb(NO3)2配制.

1.2 重金属抗性菌株的分离及其对重金属的抗性

从广东韶关凡口铅锌矿废弃地距地表5～10 cm采集土壤样品，土壤样品采用梯度稀释法制菌悬液，取0.2 mL菌悬液分别涂布于含有5 mmol/L Zn2+和1.5 mmol/L Pb2+的培养基表面，28 ℃下培养待长出菌落后挑取细菌单菌落，经多次纯化后，转至斜面4 ℃保藏.然后进一步研究筛选到的抗性菌株对Zn2+和Pb2+的抗性，用最小抑制浓度(能够抑制细菌生长繁殖的最低药物浓度)来表示细菌对重金属的抗性.

1.3 温度、pH和盐度对菌株生长的影响

供试菌株活化24 h后，接种到液体培养基中，摇床培养(150 r/min) 2 d，取10 mL菌悬液到200 mL液体培养基中，分别在温度为17、22、27、32、37 ℃，pH为3、5、7、9、11、13，NaCl质量分数为0.1%、2%、4%、6%、8%和10%的条件下，摇床培养(150 r/min)3 d，用UV-1206型分光光度计测定菌悬液的OD600，每个处理3个重复.

1.4 Zn2+、Pb2+对菌株生长曲线的影响

供试菌株活化24 h后，接种到液体培养基中，摇床培养(150 r/min)2 d，取10 mL菌悬液到200 mL液体培养基中，分别在Zn2+浓度为0、10、20、30、40 mmol/L和Pb2+浓度为0、1、2、3、4、5 mmol/L条件下摇床培养(150 r/min)，每隔4 h用UV-1206型分光光度计测定不同金属浓度下菌悬液的OD600.每个处理3个重复.

1.5 菌株的重金属吸附特性

供试菌株活化24 h后，接种到液体培养基中，摇床培养(150 r/min)2 d，取10 mL菌悬液到Zn2+浓度为10 mmol/L和Pb2+浓度为2 mmol/L的液体培养基中，28 ℃摇床(150 r/min)培养.每隔10 h，7 000 r/min离心10 min，上清液中的重金属含量使用原子吸收分光光度计(Z-2000)测定，同时收集烘干菌体，计算菌体对重金属的吸附量和吸附率.

吸附量=(C1-C2)V/M,

吸附率=(C1-C2)/C1×100%,

式中，C1表示溶液初始的重金属离子质量浓度(mg/L)，C2表示上清液中残余的重金属离子质量浓度(mg/L)，V表示吸附溶液的体积(L)，M表示菌体干质量(g).

2 结果与分析

2.1 Pb2+和Zn2+抗性菌株的分离

利用含Pb2+和Zn2+的培养基来分离筛选重金属抗性菌株，在Pb2+浓度为1.5 mmol/L和Zn2+浓度为5 mmol/L培养基分别得到2株和4株细菌，菌株编号分别为MS1、MS2、MS3、MS4、MS5和MS6.

2.2 细菌对重金属的抗性

菌株MS1对Pb2+和Zn2+的抗性最强(表1、表2)，最小抑制浓度分别为4、40 mmol/L.因此，选择菌株MS1作为抗性最佳的功能菌株，进一步研究其生物学特性及其对Pb2+和Zn2+的吸附能力.

表1 菌株对Pb2+的抗性Table 1 The Pb2+-resistance of bacterial strains

注：“+++”表示供试菌株生长良好，“++”表示生长较好，“+”表示生长一般，“+-”表示生长差，“-”表示不生长，下表同.

表2 菌株对Zn2+的抗性Table 2 The Zn2+-resistance of bacterial strains

2.3 温度、pH和盐度对菌株MS1生长的影响

菌株MS1能在17～37 ℃生长良好，最适温度为27 ℃(图1A).菌株MS1在较广泛的pH范围内生长，在pH 5～11生长良好，最适pH为7(图1B).菌株MS1广泛地生长在不同NaCl质量分数的液体培养基中，从0.1%到10%都能生长，最适盐度为4%(图1C).

图1 温度、pH和盐度对菌株MS1生长的影响

2.4 Pb2+和Zn2+对菌株MS1生长的影响

MS1菌株生长在没有加重金属的对照组中，其延滞期大约为4 h(图2)，最大OD600值为1.17；当Pb2+浓度为1、2、3 mmol/L时，菌株MS1生长曲线与对照组基本相同，最大OD600值分别为1.12、1.05和1.01，表明菌株生长没有受到影响；当Pb2+浓度为4、5 mmol/L时，延滞期延长，分别为24、40 h左右，最大OD600值分别为0.93和0.43，表明菌株MS1的生长受到了明显的抑制作用.

图3表明，当Zn2+浓度为10、20、30、40 mmol/L 时，延滞期延长，大约在12～16 h左右， 最大OD600值分别为1.11、1.05、0.98和0.79.

图2 Pb2+对菌株MS1生长的影响

图3 Zn2+对菌株MS1生长的影响

总之，当Pb2+浓度低于3 mmol/L和Zn2+浓度低于30 mmol/L时，不影响菌株MS1的生长，超过这个范围时对菌株生长影响较大.

2.5 菌株MS1吸附重金属特性

细菌培养10～30 h内，处于对数生长期，菌体活性强，吸附量增长较快，随后细菌生长进入平稳期和衰亡期，吸附量增长较慢并逐渐趋于稳定，最大值分别达到13.9、20.0 mg/g.此外，整个生长过程中菌株MS1对Zn2+的吸附量要大于Pb2+，前者是后者的1.5倍(图4).

菌株MS1对重金属Pb2+和Zn2+的吸附率随着细菌的生长繁殖而不断增加.10～30 h内，吸附率快速上升，随后增速稍有下降，60 h时菌株MS1对Pb2+和Zn2+的吸附率分别达到23.3%和25.2%.此外，整个生长过程中菌株MS1对Zn2+的吸附率要高于Pb2+(图5).

图4 菌株MS1对Pb2+和Zn2+的吸附量

图5 菌株MS1对Zn2+和Pb2+的吸附率

3 讨论

菌株MS1对重金属Pb2+和Zn2+表现出很强的抗性，最小抑制浓度分别为4、40 mmol/L(表1、表2).在液体培养过程中，当Pb2+浓度低于3 mmol/L和Zn2+浓度低于30 mmol/L时，对菌株MS1生长影响不大 (图2、图3).由此可见，菌株MS1对Zn2+和Pb2+有很强的抗性.张汉波等[4]、曹小红等[3]分别分离到耐受Pb2+的细菌，PAGUELO等[5]分离的细菌Ochrobactrumsp.Zn2+、Pb2+对其的最小抑制浓度分别为10、7 mmol/L,XIE等[6]从铜矿分离细菌，其在固体培养基和液体培养基对Zn2+最大耐受浓度分别为35、40 mmol/L.

微生物对Pb2+和Zn2+的抗性主要通过吸附固定、络合、甲基化等作用方式产生.产气克氏杆菌的抗重金属菌株能使Zn2+、Pb2+和Hg2+形成不溶性的硫化物颗粒，沉淀在细胞外表面.许多微生物可以合成具有结合重金属的胞内蛋白，这种蛋白质对Zn2+、Pb2+和Cu2+等重金属有很强的结合能力，从而降低细胞内重金属的生物有效性，有效地降低了重金属对细胞的毒性，从而增强了菌株对重金属的抗性[7-8].本实验中，凡口铅锌矿常年受到Pb2+和Zn2+污染，由于环境选择的压力，菌株MS1细胞内可能产生了较多的能与Zn2+和Pb2+结合生成无毒螯合物的蛋白质，从而提高了对Zn2+和Pb2+的抗性.

本实验中， 菌株MS1对Zn2+和Pb2+都有一定的吸附作用，最大吸附量分别为20.0和13.9 mg/g，最大吸附率分别为25.2%和23.3%(图4、图5)，对Zn2+的吸附能力要强于Pb2+，这可用“吸附+细胞膜传输”模型来解释[9-10].该模型认为菌体对金属的吸附分为直接结合在细胞表面的物理吸附过程和靠细胞代谢向细胞内转移运送的生物学过程.Zn2+的毒性相对较小，且是一种生长必须的微量元素，多数微生物都存在主动吸收的机制.因此生长繁殖的细胞除表面积累外，还将Zn2+离子转移进入细胞内部，供菌体生长代谢需要.由于Pb2+离子毒性较大，生长的菌体可能没有通过胞内运输过程，没有对Pb2+离子进行主动吸收，所以环境中重金属离子的减少可能主要是通过菌体细胞的表面积累.

4 结论

从广东凡口铅锌矿分离到1株重金属抗性细菌菌株MS1，菌株MS1对Pb2+和Zn2+的最大耐受浓度分别为4、40 mmol/L.当Pb2+浓度低于3 mmol/L和Zn2+浓度低于30 mmol/L时，对菌株MS1生长的影响不大.菌株MS1对Zn2+和Pb2+有较强吸附作用，其中对Zn2+的吸附能力大于对Pb2+的吸附能力.菌株MS1可用于重金属污染水体的修复.

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PbandZnResistanceandAdsorptionofBacterialStrainMS1

WU Fangmeng1， HE Huidong1， YAN Junlan1, YANG Danjing2， JING Yuanxiao1*
(1.Key Laboratory of Ecology and Environmental Science of Guangdong Higher Education, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China; 2.Guangzhou Research Academy of Environmental Protection, Guangzhou 510620, China)

A heavy metal-resistance bacterial strain MS1 was isolated from the Fankou Pb-Zn mine tailings in Guangdong Province. The minimum inhibiting concentrations of Pb2+and Zn2+to the strain were 4 and 40 mmol/L, respectively. Strain MS1 could grow at temperatures 17-37 ℃, pH 3-13 and high salinity conditions, with optimal conditions of temperature 27 ℃, pH 7.0 and 5% salinity. The maximum adsorption quantities and the maximum adsorption rates of strain MS1 to Pb2+and Zn2+were 13.9, 20.0 mg/g and 23.3%, 25.2% at 2 mmol/L Pb2+and 10 mmol/L Zn2+within 60 h, respectively. The adsorption ability of strain MS1 to Zn2+was greater than Pb2+. In a word, strain MS1 had strong resistance and adsorption ability to Pb2+and Zn2+, and could be used to remediate heavy metal polluted water.

2012-01-03

广东省科技计划项目(2005B33302014)

*通讯作者，jingyx@scnu.edu.cn

1000-5463(2012)03-0116-04

Q939

A

10.6054/j.jscnun.2012.06.025

Keywords： Zn2+; Pb2+; heavy metal resistance; bacterium; adsorption

【责任编辑 成 文】