携带mIFN－γ的溶瘤病毒CNHK300－mIFN－γ对肿瘤细胞的体外杀伤作用*

彭林辉， 周 杰， 霍 枫， 蒲淼水， 张 琪， 苏长青， 钱其军， 万云乐

(1南方医科大学南方医院肝胆外科，广东广州510515;2中山大学孙逸仙纪念医院肝胆外科，广东广州510210;3广州军区广州总医院肝胆外科，广东广州510010;4中山大学第三附属医院肝脏病医院实验室，广东广州510630;5第二军医大学东方肝胆外科医院基因－病毒治疗实验室，上海200438)

溶瘤病毒是应用基因工程的方法将病毒基因组进行改造，使得病毒感染、复制及溶解细胞的能力在肿瘤细胞内得到有效增强，而对正常细胞影响大为减少;其相应的治疗理念被称为病毒治疗［1］，是肿瘤治疗的研究热点。但进入临床发现，单纯病毒治疗时肿瘤的杀伤效率不够高，如研究较为成功的溶瘤病毒ONYX－015单独应用治疗头颈部肿瘤有效率不到10%［2］。理论上，在溶瘤腺病毒中插入具有抗癌作用的基因，相应的细胞因子将随着病毒在肿瘤细胞中感染、增殖而大量表达，协同杀灭肿瘤，这是更有前景的抗癌新策略［3］。我们将具有抗肿瘤作用的小鼠干扰素 γ(mouse interferonγ，mIFN－γ)基因插入溶瘤病毒CNHK300，构建了基因病毒治疗系统CNHK300－mIFN －γ(CNHK300 －Mγ)［4］。为了明确治疗基因插入是否影响溶瘤病毒的抗肿瘤作用和插入基因的表达情况，本研究采用人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株SMMC－7721、人胰腺癌细胞株PANC－1和正常人成纤维细胞株BJ，以CNHK300、ONYX－015和携带 mIFN－γ的非增殖型腺病毒AdEasy－mIFN －γ(AdEasy－Mγ)作为对照，进行CNHK300－Mγ的抗肿瘤实验研究。

材料和方法

1 材料来源

人胚胎肾(HEK)293细胞株购自Microbix Biosystems。细胞株 BJ、A549和 PANC－1购于 American Type Culture Collection(ATCC)，细胞株SMMC－7721购于中国科学院上海细胞研究所。腺病毒ONYX－015由美国加州大学Berk AJ教授惠赠。重组腺病毒CNHK300、CNHK300－Mγ和AdEasy－Mγ由本实验室重组并保存。各细胞株培养液、培养血清及抗生素参照供应商推荐，在37℃、5%CO2条件下培养，0.25%胰酶消化细胞、传代。

2 主要方法

2．1 病毒的扩增与纯化 腺病毒扩增采用HEK293细胞;病毒纯化采用常规氯化铯梯度离心纯化法;采用Qbiogene公司的TCID50法测定病毒滴度。

2．2 病毒增殖实验 分别收集上述肿瘤及正常细胞株、计数，按5×106cells/well接种6孔板。24 h后当肿瘤细胞达到对数生长期，正常细胞达到接触抑制，按感染复数(multiplicity of infection，MOI)=5分别感染 CNHK300－Mγ、CNHK300和 ONYX－015。MOI为病毒数量与细胞数量之比。感染2 h后，将培养液替换成5%血清培养液，放置在37℃、5%CO2孵箱中培养。收集感染0、48 h细胞冻融液及上清，TCID50法测定病毒滴度，以0 h病毒滴度为对照，算出病毒的增殖倍数。

2．3 细胞病理效应(cytopathic effect，CPE) 将上述肿瘤及正常细胞按5×104cells/well的密度植入24孔板中，每孔加入1 mL的培养基。24 h后对细胞换用无血清培养液，按 MOI=0、0．01、0．1、1、10、100分别加入病毒CNHK300－Mγ、CNHK300和ONYX－015，十字法摇匀，2 h后换用5%血清培养液，37℃、5%CO2孵箱培养7 d，每天观察细胞的生长情况，7 d后吸掉细胞培养液，每孔加入500 μL结晶紫染色液(2%结晶紫溶于20%甲醇)，室温染色15 min，在纯水中充分洗涤掉多余染液后拍照记录。

2．4 细胞杀伤实验 接种上述肿瘤及正常细胞至96孔细胞培养板(1×104cells/well)，用含10%胎牛血清的DMEM培养液在5%CO2条件下培养24 h，按梯度MOI值感染细胞，分别加入病毒CNHK300－Mγ、CNHK300和ONYX－015，7 d后弃去病毒残液，四唑盐比色实验(MTT assay)检测3种病毒对各种细胞的杀伤作用。用酶联免疫检测仪在570 nm波长下测定光吸收值，参考波长为650 nm。每个病毒MOI值做8个复孔，独立重复3次。

2．5 双抗体夹心酶联免疫吸附实验(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA) 分别收集上述肿瘤及正常细胞株、计数，按5×104cells/well接种24孔板。24 h后当肿瘤细胞达到对数生长期，正常细胞达到接触抑制，分别按MOI=1感染CNHK300－Mγ和AdEasy－Mγ。感染2 h后，将培养液替换成5%血清培养液，放置在37℃、5%CO2孵箱中培养。收集感染3 d、7 d细胞培养上清液，用ELISA检测其中mIFN－γ的表达量。

3 统计学处理

实验均重复3次，数据以均数±标准差(¯x±s)表示，用统计学软件SPSS 17．0进行统计学分析，采用单因素方差分析和相关分析检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 CNHK300－Mγ和CNHK300病毒的扩增与纯化

与野生型腺病毒比较，重组病毒CNHK300由人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)启动子调控E1A基因，而重组腺病毒CNHK300－Mγ，在hTERT之前插入了CMV启动子调控mIFN－γ的基因表达盒。病毒在HEK293细胞中反复扩增到需要量，纯化后进行滴度测定，CNHK300－Mγ和CNHK300滴度测定分别为1．0×1012pfu/L和1．6×1012pfu/L。

2 3种病毒在肿瘤细胞和正常细胞中的增殖情况

携带治疗基因的溶瘤腺病毒CNHK300－Mγ在恶性肿瘤细胞中选择性增殖，在肿瘤细胞株中的增殖倍数是正常细胞株中的数百倍(P＜0．01)，见图1。在肿瘤细胞株和正常细胞株增殖差异比较中发现，A549/BJ、SMMC －7721/BJ和 PANC －1/BJ在CNHK300－Mγ分别为157、622和540，在 CNHK300分别为233、204和262，在 ONYX－015分别为15、1.2和12。由此可见，与 CNHK300相比，mIFN－γ基因插入后，在各种细胞中的增殖能力均有所下降，但肿瘤细胞内的选择性增殖能力没有下降;与ONYX－015相比，CNHK300－Mγ显示出更为特异的肿瘤细胞内选择性增殖能力(P＜0．01)。

Figure 1．The replicative folds of CNHK300－Mγ，CNHK300 and ONYX－015 in normal and cancer cell lines．¯x±s．n=5，＊＊P ＜0．01 vs BJ;#P ＜0.05，##P ＜0．01 vs ONYX －015．图1 3种病毒在肿瘤细胞和正常细胞中48 h的增殖情况

3 3种病毒对肿瘤细胞株和正常细胞株的杀伤能力

图2 显示，CNHK300－Mγ对肿瘤细胞株的杀伤能力明显高于正常细胞株，在MOI值为1时均基本杀灭，而正常细胞株MOI值为100时才有杀伤力。与ONYX－015相比，CNHK300－Mγ在肿瘤细胞株的杀伤能力明显增强，而在正常细胞株中杀伤力进一步减弱。

Figure 2．The killing effect of CNHK300－Mγ，CNHK300 and ONYX －015 in normal and cancer cell lines detected by cytopathic effect assay．1:CNHK300;2:ONYX －015;3:CNHK300－Mγ．图2 3种病毒在肿瘤细胞和正常细胞中的细胞病理效应

4 3种病毒对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤作用

CNHK300－Mγ和CNHK300均显示了对肿瘤细胞株强大的选择性杀伤力，肿瘤细胞株与正常细胞株之间杀伤力差异有统计学意义(P＜0．01)，见图3。ONYX－015虽然对肿瘤细胞株有较强的杀伤作用，但要获得与CNHK300－Mγ和CNHK300同样的效果，需要更高的MOI值(P＜0．01)，而对于正常细胞株，获得类似效果，更低的 MOI值就可达到(P＜0.05)。病毒对不同细胞增殖的半数抑制浓度表明，与ONYX－015相比，CNHK300－Mγ对正常细胞株的杀伤力减弱，但对肿瘤细胞的杀伤力明显提高，特别是在SMMC－7721中，后者是前者的93倍，见表1。

Figure 3．The viability of normal and cancer cell lines infected with the 3 viruses at various MOI detected by MTT assay．¯x±s．n=24．#P＜0.05，##P＜0.05 vs ONYX－015．图3 3种病毒在肿瘤细胞和正常细胞中的细胞杀伤实验

表1 3种病毒对不同细胞增殖的半数抑制浓度Table 1．The 50%inhibitory concentration(IC50)of the 3 viruses for various cell lines(pfu/cell)

5 mIFN－γ的表达

AdEasy－Mγ是携带mIFN－γ的非增殖型腺病毒，感染恶性肿瘤细胞后只有少量mIFN－γ的表达，感染时间延长，表达量变化不大，均低于1 500 ng/L;而CNHK300－Mγ感染恶性肿瘤细胞受后均有大量mIFN－γ的表达，均高于18 000 ng/L，感染的时间延长，表达量均成倍上升，在第3 d时后者为前者的17～334倍之间，在第7 d时后者为前者的272～5526倍之间，差异均有统计学意义(P＜0．01)，见图4。然而正常细胞株BJ，2种病毒感染后，mIFN－γ的表达量相似，均不高，感染的时间延长变化也不大(P＞0.05)。

Figure 4．The expression level of mIFN－γin the supernatants of cells infected with CNHK300－Mγor AdEasy－Mγ．¯x±s．n=15，＊＊P＜0．01 vs BJ;##P＜0．01 vs AdEasy－Mγ．图4 2种病毒在不同细胞株上清液中mIFN－γ的表达量

讨 论

在病毒增殖必需基因的上游插入肿瘤组织特异性启动子或增强子，可以使病毒只在特定的肿瘤细胞内增殖，而在其它细胞内处于失活状态，如甲胎蛋白(alpha－ fetoprotein，AFP)启动子［5］、前列腺癌特异性抗原(prostate － specific antigen，PSA)启动子［6］、缺氧启动子［7］、hTERT启动子等。人端粒酶是一种特殊的逆转录酶，在85%以上的肿瘤细胞中高表达，由端粒酶RNA、端粒酶结合蛋白和hTERT构成，其中hTERT的表达与端粒酶活性高度相关［8］，是决定其活性的主要因素［9］。CNHK300病毒系统是本室构建的用hTERT启动子控制E1A表达而获得的溶瘤病毒，具有选择性裂解端粒酶阳性肿瘤细胞的能力，与ONYX－015相比，在体外实验和荷瘤动物实验均显示了更强的抗肿瘤效果［10］。

为了优化溶瘤病毒的抗癌性，我们进一步将CNHK300携带上治疗基因，期望治疗基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中选择性地高表达，增强抗肿瘤效果。IFN－γ是已证实有多重抗癌作用的细胞因子，其机制主要有［11－12］:(1)多重的免疫调节作用:调节MHCⅠ和MHCⅡ类分子在大多数免疫细胞内的表达;诱导Th2向Th1分化，减少病毒抗体产生;增加LAK(淋巴因子激活的杀伤细胞)的抗肿瘤活性;增强肿瘤坏死因子的抑瘤作用等;(2)直接抑制肿瘤血管生成;此外，它还能影响细胞周期，诱导细胞凋亡，直接杀伤肿瘤细胞。目前IFN－γ已应用到临床试验中［13］，但是半衰期短、稳定差、活性低、费用高，高剂量反复注射方能取得一定的疗效，应用明显受限。

前期研究中我们将含mIFN－γ的外源基因表达盒插入到溶瘤病毒CNHK300的基因组中，成功地构建一种新的基因－病毒治疗系统CNHK300－Mγ［4］。本研究发现mIFN－γ基因插入后，溶瘤病毒在各种细胞株中的增殖能力和杀伤能力均有所降低，但正常细胞下降更明显，与CNHK300相比肿瘤细胞内选择性增殖能力和对肿瘤细胞的选择性杀伤能力均无明显下降，与ONYX－015相比，在肿瘤细胞中增殖能力和杀伤能力明显增强，而在正常细胞中的毒性进一步下降。由此可见mIFN－γ基因的插入没有改变溶瘤病毒自身特异性杀灭肿瘤细胞的能力。与AdEasy－Mγ相比，CNHK300－Mγ在恶性肿瘤细胞中能随着病毒的增殖大量表达mIFN－γ，并随时间相对延长，表达量成倍上升，能有效避免传统基因治疗中治疗基因表达率低的主要缺点。

肺癌、肝癌和胰腺癌均是我国常见的重大疾病，一经确诊大部分为中晚期，治疗非常棘手且预后不理想。国内外文献报道端粒酶阳性率在肺癌、肝癌和胰腺癌中为80%～100%，端粒酶活性的表达和肿瘤侵润深度、淋巴结转移及肿瘤分期显著相关［9，14－15］。CNHK300 －Mγ 具有类似 CNHK300 的选择性裂解端粒酶阳性肿瘤细胞的能力，同时也能随着病毒大量增殖高效表达IFN－γ，具备了基因治疗和病毒治疗的双重抗瘤作用，进一步动物实验极可能显示比CNHK300更强的抗瘤效果，拥有较高的恶性肿瘤治疗潜力。

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