睑裂狭小综合征Ⅱ型一家系未检测到FOXL2基因突变△

温臣婷 唐 微 李国保 张有顺

睑裂狭小综合征(blepharophimosis ptosis epicanthus inversus syndrome，BPES)是一种少见的常染色体显性遗传疾病[1]。临床上以睑裂狭小、倒转型内眦赘皮及上睑下垂三联征为主要特征。BPES可分为两种类型:Ⅰ型女性患者不孕，而男性患者可生育，并将这一性状传递给下一代。Ⅱ型患者男女均可生育。研究表明 FOXL2基因定位于3q22.3-3q23区域[2]，由长2.7 kb的单个外显子组成。其编码蛋白质属于forkhead转录因子大家族，由376个氨基酸组成。目前，虽然国内外的学者报道了一些BPES家系或散发病例，并检测到病因与其存在的FOXL2基因突变有关。但是不同的家系其基因突变类型可能并不相同。我们研究的家系中男女患者均可生育，因此确诊为Ⅱ型家系病例，其中3名患者以后将存在生育需求。本研究将对一个来自中国连续传递3代BPES家系的FOXL2基因进行突变分析。

1 资料与方法

1.1 研究对象 该BPES家系来自于河南省某县，共3代5例发病(其中1例为新生儿未采血)，表现为典型的常染色体显性遗传，从第1代发现第1例患者开始，每一代均有患者，共计男3例，女2例，年龄6个月～60岁。家系图谱见图1。该家系所有患者均有典型的睑裂狭小、上睑下垂、倒转型内眦赘皮、眦距增宽和弱视(图2)，其中有3例患者曾在我院接受手术治疗，效果较满意。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA获取 将家系中4例患者(新生儿血液未采集)及家系中5例正常成员作为研究对象，另外选取30例正常人作为正常对照，均抽取其外周全血约2 mL。利用Omega公司提供的基因组抽提试剂盒，并参照试剂盒使用说明从全血中抽取基因组DNA，置于-20℃保存待用。

Figure 1 Pedigree of BPES patients 患者家系图

Figure 2 Photographs of patients.A:Photograph of patientⅡ1 after the second phase surgery;B:Photograph of patient ofⅡ2 after the first phase surgery;C，D:Photographs of the patientⅢ1 before surgery(C:Right eye;D:Left eye);E:Photograph of the patientⅢ1 after the first phase surgery 患者照片。A:患者Ⅱ1二期术后照片;B:患者Ⅱ2一期术后照片;C、D:患者Ⅲ1手术前照片(C:右眼，D:左眼);E:患者Ⅲ1一期手术后照片

1.2.2 PCR 反应 根据 NCBI GenBank数据库提供的 FOXL2基因序列(Gene ID:668)，设计合成FOXL2基因的特异引物:从FOXL2基因启动子区至整个编码区，设计特异性引物5对(表1)，应用PCR技术分段扩增FOXL2基因片段。PCR反应体系:总体积为 25 μL，2 × GC buffer Ⅱ12.5 μL，10 mmol·L-1双向引物各 1 μL，2 mmol·L-1dNTP 5 μL，Taq DNA 酶0.25 μL，模板为基因组 DNA 3 μL，余不足用水补齐，反应试剂由大连宝生物公司提供。PCR反应程序:为预变性94℃ 1 min，然后94℃30 s→退火30 s→72℃ 2 min，共35个循环。扩增后，取PCR产物 25 μL，加 6 × loading buffer 5 μL 上样，用20 g·kg-1琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR产物大小。切胶回收PCR产物中目的片段，用Promega公司凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段，取1 μL目的片段上样，电泳检测(琼脂糖凝胶经EB染色)，进一步确认PCR产物为所需片段。用ABI3730DNA测序仪进行测序。

1.2.3 基因分析 对测序获得的序列与标准序列进行相似序列比对，确定突变位点。

2 结果

2.1 基因组DNA提取及其检测 提取的DNA经凝胶电泳检测，出现一条较整齐、明显的条带，条带＞2 kb，说明提取到的DNA质量好，能作为PCR扩增的模板(图3)。

表1 FOXL2的PCR扩增引物序列、扩增时的退火温度及扩增片段长度Table 1 Primer sequences，Tm and PCR product length of FOXL2 gene

2.2 PCR产物 PCR产物电泳后发现，5对引物都扩增到了与预期产物一致的DNA条带(图4)，其中AB引物扩增的产物在近500 bp处出现一条带，与预期的473 bp相一致;CD引物扩增的产物在600～700 bp间出现一条带，与预期的656 bp相一致;EF引物扩增的产物在近500 bp处出现一条带，与预期的494 bp相一致;GH引物扩增的产物在近600 bp处出现一条带，与预期的561 bp相一致;MN引物扩增的产物在近600 bp处出现一条明显的带，但位置较GH条带略高，与预期的579 bp相一致。

2.3 FOXL2基因测序 将上述扩增后的基因片段进行挖胶纯化回收后，送到大连宝生物公司进行测序。测序结果与Genebank中FOXL2序列一致:3代4例患者与家系中的正常成员和30例正常对照中FOXL2基因测序结果相同，FOXL2基因的编码区及启动子区测序结果显示均未发现FOXL2基因的突变(图5)。说明这些患者的FOXL2基因没有发生突变，该家系BPES疾病不是由FOXL2基因突变引起的。

Figure 4 Recycled DNA electrophoresis diagrams of patientⅡ1，Ⅱ2 andⅢ1 患者Ⅱ1、Ⅱ2及Ⅲ1 PCR产物片段电泳图

Figure 5 Sequence electropherograms of FOXL2.A:AB fragment part sequence electropherograms of FOXL2;B:CD fragment part sequence electropherograms of FOXL2;C:EF fragment part sequence electropherograms of FOXL2;D:GH fragment part sequence electropherograms of FOXL2;E:MN fragment part sequence electropherograms of FOXL2 FOXL2测序图。A:AB段部分测序图;B:CD段部分测序图;C:EF段部分测序图;D:GH段部分测序图;E:MN段部分测序图

3 讨论

BPES是一种少见的常染色体显性遗传病，在普通人群中的发病率大约为十万分之一。本病典型特征为双眼倒转型内眦赘皮、上睑下垂、睑裂狭小、内眦距离增宽等。BPES可分为两型，I型女性患者因卵巢功能早衰而不育，男性患者生育功能正常。Ⅱ型男女患者因只累及眼睑故均可生育[3]。I型由父亲传代，女性患者伴有不孕症，其外显率100%。Ⅱ型外显率96%，父母亲传代机会均等[4-5]，在我国所报道的病例中，父亲传代占绝大多数[6]。本研究家系患者具有典型的临床特征，女性患者生育能力正常，故属于BPESⅡ型。家系的患者是通过父亲传代的，父亲所生后代均患病，母亲所生后代未见异常。

国内外大量研究表明，BPES与FOXL2基因突变有高度密切的关系[7-12]。有散发突变和遗传突变。突变形式有:错义突变、移码突变(缺失或插入)等。FOXL2基因突变引起聚丙氨酸区域扩增可导致BPESⅡ型，而突变导致其编码的蛋白质在聚丙氨酸区域前截断的则发生Ⅰ型的风险高[13]。

然而在我们研究的家系中所有患者FOXL2基因的编码区及启动子区测序结果均未发现FOXL2基因的突变。其可能原因为:该家系的发病与FOXL2基因无关，推测可能有导致该家系患病的其他突变基因存在。此外，也可能与FOXL2基因有关，因为基因的表达不仅需要正常的编码序列，同时也需要调控区域的作用[14-16]。Crisponi等[15]在距离FOXL2基因5’端转录起始点171 kb处发现了平衡易位断点所致的BPES。Beysen等[14]报道了FOXL2基因外的微小缺失及碱基重排所致的BPES。这些调控区域和目标基因相距甚远，但却影响FOXL2的表达，从而引起BPES的表型。部分BPES患者的遗传缺陷可能代表一种基因剂量变化或者FOXL2转录区外的基因重排。该实验只对基因的外显子区和少量的内含子区及启动子区进行扩增测序，许多内含子区或其他可能的调节位点并未检测，这些可能为该家系的致病原因。除了FOXL2基因异常外，还可能存在其他的遗传因素和环境因素的作用。可能是FOXL2基因周围的位置效应;或是BPES具有遗传异质性。因此对该家系需进一步行传统的细胞遗传学调查，如行微阵列比较基因组杂交技术等，进一步查找该基因外的调节区域，寻找调控FOXL2基因表达的远距离保守非基因序列是否存在异常。

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