附子及关木通对辛伐他汀与吉非罗齐合用致横纹肌溶解模型的影响及比较

吴 琪，王友群，杜晟南，史会杰，易英豪

（1.中国药科大学 临床药学教研室，江苏 南京210009；2.中国药科大学 药理研究室，江苏 南京210009）

随着生活水平不断提高，人们的饮食营养也逐渐提升，患高血脂症的病人越来越多。他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶A（HMG－CoA）还原酶的抑制剂，此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶（HMG－CoA）还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，有效降低总胆固醇及低密度脂蛋白（LDL－c）的含量。由于其降脂作用效果显著、耐受性好而成为降脂首选药物。但患者服用他汀类药物后容易出现肌病不良反应，主要表现为肌痛、乏力、肌无力并伴随着血液中与肌肉有关的酶如肌酸激酶（CK）含量的升高，严重者肌肉纤维坏死其内容物肌红蛋白大量释放到血中，引起横纹肌溶解症。横纹肌溶解症会导致肾损伤甚至肾衰，有生命危险。若他汀类药物与另一类降脂药物贝特类药物合用，患者出现严重肌病不良反应的可能性将大大提升［1］，这可能与贝特类药物影响了他汀类药物在人体内的分解代谢有关［2］。本实验选用他汀类药物中出现肌病不良反应较多［3，4］，且使用广泛的辛伐他汀（sv）加用贝特类药物吉非罗齐（gfz）作为造模药进行造模，以血清中CK值为主要指标，在小鼠身上模拟出横纹肌溶解的模型。在此造模药的基础上，加给性大热的附子和性寒的关木通，探究这两味药性相反的中药对该模型有何影响并且进行差异比较，初步探讨可能的作用机制。

1 材料

1.1 动物

雄性ICR小鼠138只，体重（30±2）g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖厂，动物合格证号：SCXK（苏）2007－0001。实验期间给予标准饲料，自由摄食饮水，室内温度控制在20℃～25℃。

1.2 药品与试剂

关木通饮片（批号：100401）购自南京市百信药房，附子（批号：100726）购自南京市益丰大药房；辛伐他汀片（批号：110244），由杭州默沙东制药有限公司提供，吉非罗齐胶囊（批号：100107），由湖南千金湘江药业股份有限公司提供。肌酸激酶（CK）、肌酐（Cr）、尿素氮 （BUN）、MDA、组织蛋白等试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器

721分光光度计（上海第三分析仪器厂）；0412－1型低速离心机 （上海医疗器械有限公司手术器械厂）；BS－110－S型电子天平 （北京赛多利斯公司）。

2 方法

2.1 中药水煎剂的制备

称取适量附子，加入8倍体积的自来水，浸泡1h，武火煮沸后微沸1h，4层纱布过滤，收集滤液；残渣加入6倍体积的自来水，微沸30min，亦过滤；合并两次滤液，文火浓缩，得每毫升相当于0.3g附子的水煎液。以相同方法制备每毫升相当于0.5g关木通的水煎液。

2.2 分组及给药

将小鼠随机分为七组：正常对照组（C组，10只），低剂量模型组（M1组，16只），高剂量模型组（M2组，16只），M1＋关木通组（M1＋G组，24只），M1＋附子组（M1＋F组，24只），M2＋关木通组（M2＋G组，24只），M2＋附子组（M2＋F组，24只）。C组灌胃等体积饮用水。M1组从第8天起每天灌胃给予辛伐他汀（40mg·kg－1，晚上1次）及吉非罗齐（600mg·kg－1，早晚各1次），持续4周；M1＋G组和 M1＋F组从第1天起给予相应的中药水煎剂，持续5周，从第8天开始加给造模药辛伐他汀（40mg·kg－1，晚上1次）及吉非罗齐（600mg·kg－1，早晚各1次）。M2组从第8天起每天灌胃给予辛伐他汀（80mg·kg－1，晚上1次）及吉非罗齐（600mg·kg－1，早晚各1次），持续4周；M2＋G和 M2＋F组从第1天起给予相应的中药水煎剂，持续5周，从第8天开始加给造模药辛伐他汀（80mg·kg－1，晚上1次）及吉非罗齐（600mg·kg－1，早晚各1次）。各附子给药组均为上午给药，给药体积为每10g体重0.1mL；各关木通给药组均为上午给药，给药体积为每10g体重0.1mL，且每周连续给药4天，停药3天。

实验过程中，某些组的死亡率过高就提前处理。具体的动物处理情况如下：①实验第11天，M1＋G组的死亡率达到75%，故提前全部处理。②第17天，M2组和M2＋G组的死亡率分别达到56%和71%，故提前全部处理；M2＋F组处理部分，记做M2＋F（17天）组。③第21天，C组处理部分，记做C（21天）组；M1处理部分，记做 M1（21天）组；M1＋F组部分处理，记做 M1＋F（21天）组；M2＋F剩余动物全部处理，记做M2＋F（21天）。④实验第35天，C组、M1组、M1＋F组剩余动物均全部处理，分别记做C（35天）组、M1（35天）组和 M1＋F（35天）组。

2.3 取材、样品制备及指标测定

于实验结束时，摘除小鼠眼球，取其全身血液致死，血样在2 000r·min－1转速下离心10min，然后取上层血清测定其中CK、Cr、BUN等指标的含量；解剖小鼠取右侧肾脏，计算肾脏系数（单侧肾脏质量／小鼠体重）；取左侧肾脏组织，按质量体积比1∶9加入生理盐水，在冰浴条件下制成肾组织匀浆，在3 000r·min－1转速下离心10min后取上清液，测定其中MDA的含量及组织蛋白浓度；以相同方法制备肝组织匀浆，并测定其中MDA的含量及组织蛋白浓度。

2.4 统计学处理

3 结果

C（21天）组及C（35天）组两批对照组的小鼠的肾系数、尿素氮（BUN）、血清肌酐（Cr）、肾组织蛋白含量、肝组织蛋白含量和肝组织蛋白中的MDA水平等指标无显著性差异，说明该指标在正常小鼠中比较稳定，故将C（21天）组小鼠作为前三批处理的所有小鼠的对照组。而C（21天）组及C（35天）组两批小鼠的血清肌酸激酶（CK）和肾组织蛋白中的 MDA水平有显著性差异（P＜0.01、P＜0.05和P＜0.05），故只进行同一处理批次内的对比。

3.1 左肾系数

结果显示，前三批处理的小鼠中，与C（21天）组相比，M1＋G组、M2＋G组和M2＋F（17天）组的肾系数均显著升高（P＜0.001、P＜0.001和P＜0.05），其他组与 C（21天）组相比无明显差异；与M2相比，M2＋G组的肾系数显著升高（P＜0.001），M2＋F（17天）组无明显差异，仅略有升高趋势。实验35天处理的小鼠中，与C（35天）组相比，M1（35天）组及 M1＋F（35天）组与C（35天）组相比肾系数无明显差异；与 M1（35天）组，M1＋F（35天）组的肾系数无显著性变化；与前一批次相比，M1（35天）组和 M1＋F（35天）组无显著性变化。各组实验数据见表1。

表1 各组小鼠肾系数（s，n为5～8）

表1 各组小鼠肾系数（s，n为5～8）

注：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001，与 C组比较；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，＃＃＃P＜0.001，与 M2组比较。

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3.2 血清肌酸激酶、肌酐、尿素氮

结果显示，实验17天处理的小鼠中，与M2组相比，M2＋F（17天）组小鼠的CK水平显著降低（P＜0.05），M2＋G组无明显差异，略有上升。实验21天处理的小鼠中，与C（21天）组相比，M1（21天）组、M1＋F（21天）组、M2＋F（21天）组CK水平均显著升高（P＜0.001、P＜0.05和P＜0.001）；与 M1（21天）组相比，M1＋F（21天）组的CK水平显著降低（P＜0.05）；与 M2＋F（17天）组相比，M2＋F（21天）组CK水平显著升高（P＜0.05）。实验35天处理的小鼠中，与C（35天）组相比，M1（35天）组的CK水平显著升高（P＜0.05），M1＋F（35天）组无明显差异，仅略有升高；与M1（35天）组比较，M1＋F（35天）组的CK水平显著降低（P＜0.05）；与前一批次相比，M1（35天）组和 M1＋F（35天）组无显著性变化。

在前三批处理的小鼠中，与C（21天）组相比，M2＋G组、M2＋F（21天）组、M1（21天）组的Cr水平均显著升高（P＜0.001、P＜0.001和P＜0.05）；与 M2组相比，M2＋G组的Cr水平显著升高（P＜0.01），M2＋F（17天）组无明显变化；与 M1（21天）组相比，M1＋F（21天）组显著降低（P＜0.05）；与 M2＋F（17天）组相比，M2＋F（21天）组Cr显著升高（P＜0.05）。实验35天处理的小鼠中，与C（35天）组相比，M1（35天）组与M1＋F（35天）组的Cr水平均显著升高（P＜0.01和P＜0.05）；与前一批次相比，M1（35天）组和M1＋F（35天）组Cr水平均无明显变化。

在前三批处理的小鼠中，与C（21天）组相比，M1＋G组、M2＋G组、M1（21天）组、M1＋F（21天）组的BUN水平均显著升高（均为P＜0.05）；与M2组相比，M2＋G组的BUN水平显著升高（P＜0.05），M2＋F（17天）组无明显变化；与 M1（21天）组相比，M1＋F（21天）组无明显变化；与M2＋F（17天）组相比，M2＋F（21天）组BUN水平无明显变化。实验35天处理的小鼠中，与C（35天）组相比，M1（35天）组与M1＋F（35天）组的BUN水平均无明显变化；与前一批次相比，M1（35天）组和M1＋F（35天）组BUN水平均显著降低（P＜0.05和P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠血清肌酸激酶、肌酐和尿素氮水平测定结果（s，n为5～8）

表2 各组小鼠血清肌酸激酶、肌酐和尿素氮水平测定结果（s，n为5～8）

注：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001，与C组比较；＆P＜0.05，＆＆P＜0.01，＆＆＆P＜0.001，与 M1组比较；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，与 M2组比较；＾P＜0.05，＾＾P＜0.01，与前一批处理比较。

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3.3 组织蛋白含量及MDA含量

前三批处理的小鼠中，与C（21天）组相比，M2组、M1（21天）组、M2＋F（21天）组的肾组织蛋白含量均显著升高（P＜0.01、P＜0.01和P＜0.05），M2＋G组的肾组织蛋白含显著降低（P＜0.01）；与 M2组相比，M2＋G组的肾组织蛋白含量显著降低（P＜0.001），M2＋F（17天）组无明显变化；与 M1（21天）组相比，M1＋F（21天）组无明显变化；与M2＋F（17天）组相比，M2＋F（21天）组无明显变化。实验35天处理的小鼠中，与C（35天）组相比，M1（35天）组的肾组织蛋白含量显著降低（P＜0.05），M1＋F（35天）组无明显变化；与前一批次相比，M1（35天）组的肾组织蛋白含量显著降低（P＜0.01），M1＋F（35天）组无明显变化。

实验17天处理的小鼠中，与 M2组相比，M2＋F（17天）组小鼠肾组织蛋白中的 MDA水平显著降低（P＜0.05），M2＋G组无明显差异，略有上升。实验21天处理的小鼠中，与C（21天）组相比，M1（21天）组和 M1＋F（21天）组肾组织蛋白中的 MDA水平显著降低（P＜0.05和P＜0.05），M2＋F（21天）组肾组织蛋白中的 MDA水平无明显变化，有下降趋势；与 M1（21天）组相比，M1＋F（21天）组无明显变化；与 M2＋F（17天）组相比，M2＋F（21天）组无明显变化。实验35天处理的小鼠中，与C（35天）组相比，M1（35天）组与M1＋F（35天）组的肾组织蛋白中的 MDA水平均显著降低（P＜0.01和P＜0.001）；与 M1（35天）组，M1＋F（35天）组的肾组织蛋白中的MDA水平显著降低（P＜0.01）；与前一批次相比，M1（35天）组和 M1＋F（35天）组均显著降低（P＜0.001和P＜0.001）。

前三批处理的小鼠中，与C（21天）组相比，M1＋G组、M2组、M2＋F（17天）组、M2＋G组、M1（21天）组、M1＋F（21天）组、M2＋F（21天）组的肝组织蛋白含量均显著升高（P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.001、P＜0.01、P＜0.001和P＜0.01）；与 M2组相比，M2＋G组的肝组织蛋白含量显著升高（P＜0.01），M2＋F（17天）组无明显变化；与M1（21天）组相比，M1＋F（21天）组无明显变化；与 M2＋F（17天）组相比，M2＋F（21天）组无明显变化。实验35天处理的小鼠中，与C（35天）组相比，M1（35天）组的肝组织蛋白含量显著升高（P＜0.05），M1＋F（35天）组无明显变化；与前一批次相比，M1＋F（35天）组的肾组织蛋白含量显著降低（P＜0.05），M1（35天）组无明显变化，有降低的趋势。

前三批处理的小鼠中，与C（21天）组相比，M2＋G组和M1（21天）组的肝组织蛋白中的MDA水平均显著升高（P＜0.05和P＜0.05），M1＋G组、M2组、M2＋F（17天）组、M1＋F（21天）组和 M2＋F（21天）组无明显变化，有升高趋势；与M2组相比，M2＋G组和 M2＋F（17天）组的肝组织蛋白中的 MDA水平无明显变化；与 M1（21天）组相比，M1＋F（21天）组无明显变化；与M2＋F（17天）组相比，M2＋F（21天）组无明显变化。实验35天处理的小鼠中，与前一批次相比，M1＋F（35天）组的肝组织蛋白中的 MDA水平显著降低（P＜0.05），M1（35天）组无明显变化，有降低趋势。见表3。

4 讨论

临床中严重肌肉疼痛和横纹肌溶解的主要特征之一为血清肌酸激酶（CK）水平升高［5］，故本实验以血清中CK值作为造模成功与否的主要指标。与C组相比，低剂量模型组（M1组）跟高剂量模型组（M2组）的血清CK值均显著升高，说明该横纹肌溶解模型造模成功。第二批处理的动物结果显示，与M2组小鼠相比，M2＋附子组的小鼠血清CK值显著降低，而M2＋关木通组的小鼠血清CK值有升高趋势。这提示性热的附子可能对该模型有保护作用，而性寒的关木通则可能会加重该模型的损伤程度。实验17天及35天处理的动物结果均显示，与M1组相比，M1＋附子组的小鼠血清CK值均降低。这进一步说明了附子对于该模型具有保护作用。

血清Cr及BUN水平与肾功能的损伤程度成正相关。与M1（21天）组相比，M1＋F（21天）组的Cr水平显著降低，M2＋F（17天）组及M1＋F（35天）组与相应的模型组相比Cr水平也有降低的趋势，说明附子对该模型具有一定的保护作用。BUN水平方面，M1＋F组、M2＋F组与相对应的模型组相比没有明显的改善。MDA是细胞膜脂质发生过氧化反应的产物，可用于反映细胞的氧化还原状态。实验21天处理的小鼠中，M1（21天）组及M1＋F（21天）组的MDA水平均低于C（21天）组，提示组织中与氧化还原相关的酶处于低活性状态，而M1＋F（21天）组的MDA水平高于M1（21天）组，说明附子可能通过改善肾脏中与氧化还原相关的酶的活性而起到一定的保护作用；实验35天处理的小鼠中肾组织MDA水平的情况为M1＋F（35天）组＜M1（35天）组＜C（35天）组，给药时间延长后，附子对模型的保护作用不再显现出来。实验21天处理的小鼠中肝组织MDA水平的情况为C（21天）组＜M1（21天）组＜M1＋F（21天）组，而实验35天处理的小鼠中肝组织MDA水平的情况为M1＋F（35天）组＜M1（35天）组＜C（35天）组。M1（21天）组与 M1（35天）组、M1＋F（21天）组与 M1＋F（35天）组相比，前后者给药剂量相同，只是实验时间前者为21天，后者为35天，肝组织内就由膜脂质过氧化反应增加的状态变成与氧化还原相关的酶处于抑制的状态，血清中Cr与BUN水平也发生了显著变化。并且，C（21天）组与C（35天）组比较，肝肾MDA、BUN水平无明显变化。因此，我们推断该模型对动物造成的损伤程度与给药时间的长短有很大关系，附子对于该横纹肌溶解模型具有保护作用，但也与给药时间的长短有关，实验前21天内附子对该模型的保护作用最为显著，具体的机制需要通过进一步实验进行探索。

表3 肝、肾组织蛋白及MDA水平测定结果（s，n为5～8）

表3 肝、肾组织蛋白及MDA水平测定结果（s，n为5～8）

注：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001，与C组比较；＆P＜0.05，＆＆P＜0.01，＆＆＆P＜0.001，与 M1组比较；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，＃＃＃P＜0.001，与 M2组比较；＾P＜0.05，＾＾P＜0.01，＾＾＾P＜0.001，与前一批处理比较。

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M1＋G组小鼠在第8天开始给造模药后大批量死亡，故在实验的第14天予以处理，M2＋G组的也因为同样的原因在第17天予以处理。以上两组均是在造模药的基础上加给予中药关木通，这两组的大批量死亡可能与小鼠肝肾均受到损伤有关。上文已提到性寒的关木通可能会加重该模型的损伤程度。另两个与肾功能的损伤程度成正相关的生化指标血清Cr及BUN水平显示，与M2组相比，M2＋G组小鼠的血清Cr及BUN水平均显著升高，左肾系数显著增加，肾蛋白含量降低，肉眼观察发现肾上有若干小血点，表明肾功能受损，导致内生Cr清除率下降，Cr排出减少，同时蛋白质分解代谢增加，从而使BUN升高，进一步提示性寒的关木通可能会加重该模型的损伤程度；M1＋G组由于与相对应的M1模型组给予造模药时间长短差太多而不好进行比较，但该组的BUN水平与M2＋G组小鼠相当，提示该组小鼠的肾脏也可能受到了一定的损伤。M2＋G组小鼠的肝蛋白含量与C组及M2组相比均显著升高，肝蛋白中的MDA水平高于M2组，肉眼观察到肝脏也有损伤，提示M2＋G组小鼠的肝也可能有一定的损伤。

他汀类药物出现肌病不良反应与其抑制脂类的生物合成及代谢过程有关。附子为温里药代表，其药味辛甘，性大热，归心、肾、脾经，走而不守，通行十二经络；功效回阳救逆，补火助阳，散寒止痛，被称为“回阳救逆第一品药”，具有非常重要的临床价值。我们初步推测附子对本实验所造的模型的保护作用可能与其性大热，能提高细胞抗氧化能力有关［6］。

本研究探索附子及关木通对他汀类药物及贝特类药物合用所致的横纹肌溶解模型的影响。结果显示，该模型对动物造成的损伤程度与给药时间长短有关，附子对这个模型能起到一定的保护作用，但与给药时间长短有一定关系，实验中附子（剂量为3g／kg）在实验前21天内对该模型的保护作用最为显著。而在造模的基础上加给关木通，会加重小鼠的肝肾方面的损伤。这两味药性相反的中药对该模型产生的影响有差异，相关的作用机制需进一步探究。

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