理囊散中水溶性成分的超声提取及促孕活性研究

曾云军，李炳奇，陈韩英，陈晴晴，谷新利

（1石河子大学化学化工学院／新疆兵团化工绿色过程重点实验室／省部共建国家重点实验室培育基地，石河子832003；2石河子大学药学院，石河子832003；3石河子大学动物科技学院，石河子832003）

奶牛不孕症中，发情周期不正常、不发情多为卵巢性疾病，据统计［1－2］，因卵巢疾病引发的奶牛不孕占总数的78.5%，每年我国仅因奶牛卵巢疾病性不孕造成的经济损失就达数亿元。兽医临床上治疗上述病症一般采用激素和抗生素制剂［3－7］，而这类药物副作用大，长期使用不仅危害动物体质，也严重影响着人类健康［8］。目前，中药复方已用于治疗奶牛不孕症，如蒲林春等［9］利用加减四物汤治疗奶牛不孕症、李焕章［10］采用复方仙阳汤治疗奶牛不孕症，罗瑞卿等［11］利用促孕散治疗奶牛不孕症均取得了良好的疗效［9－11］。

中药复方理囊散，主要用于治疗卵巢囊肿和排卵延迟等原因造成的奶牛不孕症。其由香附子、女贞子、益智仁等十余味中药组成，临床应用证明该复方作用效果持久，副作用小，具有促孕作用［12－13］。但作为纯中药散剂，其存在用药量大，药材利用率低，使用不便，质量可控性差等缺点，使其推广应用受到了很大限制。

理囊散的主要成分为挥发油、醇溶性成分、水溶性成分［14］。本研究利用超声辅助提取技术针对其水溶性成分进行提取，并采用正交实验，以水溶性成分的干膏得率为评价指标，优选最佳提取工艺条件，再通过观察其对小鼠子宫系数和卵巢的影响，探讨理囊散中水溶性成分的促孕活性，旨在为实现理囊散安全、稳定、高效、可控的质量要求奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；KQ－250B型超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；SHZ－CB循环水式多用真空泵（河南巩义市英峪予华仪器厂）；KMD型电热套（武汉精华科技有限公司）；电热真空干燥箱（上海实验仪器厂有限公司）；AR－2140型万分之一电子天平（梅特勒－托利多仪器有限公司制造）；显微镜（Olympus）。

苯甲酸雌二醇注射液（上海通用药业股份有限公司，每支1 m L，含雌二醇2 mg，批号：110514，用甘油稀释成50 g／m L）；21日雌性昆明种小鼠（由石河子大学实验动物中心提供，分笼饲养，自由饮水和进食）；中药复方理囊散由石河子大学动物科技学院中兽医实验室提供；蒸馏水（自制）。

1.2 方法

1.2.1提取方法

准确称取一定量的中药复方粉末于锥形瓶中，加一定水，在一定的提取时间、提取温度、提取次数下进行超声辅助提取，过滤，残渣按一定的提取次数提取后减压过滤，合并滤液，转移至已恒重的干燥蒸发皿中，水浴蒸至近干，置70℃的烘箱进行减压干燥至恒重，计算出干膏得率［15］（提取物的干膏质量／复方质量×100%）。

1.2.2单因素试验

1）提取温度对浸膏得率的影响。称取6份10.00 g中药复方粉末，按1∶10的料液比（M∶V），加入蒸馏水超声提取20 min，提取温度分别为25、35、45、55、65、75℃，按照“1.2.1”中的方法，计算干膏得率。

2）提取时间对浸膏得率的影响。称取8份10.00 g中药复方粉末，按1∶10的料液比加入蒸馏水，提取温度为35℃，提取时间分别为5、10、15、20、25、30、35、40 min，按照“1.2.1”中的方法，计算干膏得率。

3）料液比对浸膏得率的影响。称取6份10.00 g中药复方粉末，按料液比分别为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16，加入蒸馏水，提取温度35℃，提取时间为20 min，按照“1.2.1”中的方法，计算干膏得率。

4）提取次数对浸膏得率的影响。称取6份10.00 g中药复方粉末，按料液比为1∶10加入蒸馏水，提取温度35℃，提取时间20 min，提取次数分别为1、2、3、4、5、6次，按“1.2.1”的方法，计算干膏得率。

1.2.3正交试验

在单因素试验基础上，选择提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）、提取次数（D）为影响提取效果的主因素，以出膏量为评价指标，用L9（34）正交表安排实验，因素水平表见表1。

表1 因素水平表Tab.1 The design of factors and levels in the orthogonal test

1.2.4水溶性成分的促孕活性研究

准确称取理囊散中药粉末适量，按正交试验筛选出的最佳提取工艺进行提取，收集滤液，减压浓缩至相当于1.0 g／m L生药的溶液。

1）水溶性成分对小鼠子宫系数的影响试验［16－17］。取50只雌性小鼠，体重为9～12 g，将其随机分成5组，分别为空白对照组、雌二醇阳性对照组、水溶性成分低、中、高剂量组（2、4和6 g／kg）。空白对照组灌服给予等体积蒸馏水；阳性对照组从第4天开始腹腔注射雌二醇，0.5 mg／kg，连续给药7 d。水溶性成分组、理囊散组灌服给药，每天1次，连续给药7 d。各组小鼠于末次给药后24 h颈椎脱臼处死，剖开腹腔，摘取其子宫并称重，计算子宫系数。

2）水溶性成分对小白鼠卵巢的影响试验。取50只21日龄雌性昆明种小鼠，体重为9～12 g，将其随机分成5组，分别为空白对照组、雌二醇阳性对照组、水溶性成分低、中、高剂量组（剂量分别为2、4和6 g／kg）。正常对照组为等体积蒸馏水；阳性对照组从第4天开始腹腔注射雌二醇，0.5 mg／kg，连续给药7 d。水溶性成分组、理囊散组灌服给药，每天1次，第4天剂量加倍，连续给药7 d。各组小鼠于末次给药后24 h颈椎脱臼处死，立即切取双侧卵巢投入10%中性福尔马林中固定48 h，进行常规石蜡切片，苏木素－伊红染色，显微镜下观察其卵泡直径。将卵泡按大、中、小三类分别计数，求其百分比。卵泡分类标准为：直径在100μm以上为大型卵泡（相当于成熟卵泡），直径在100μm以下的有卵泡腔卵泡为中型卵泡（相当于各级次级卵泡），无卵泡腔的最小卵泡为小型卵泡（相当于初级卵泡和原始卵泡）。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1提取温度对浸膏得率的影响

由图1可知，随着提取温度的增加，干膏得率也随着增加，但到55℃后增加趋于缓慢，结合节能的原因，选择35、45、55℃进行正交试验。

图1 提取温度对浸膏得率的影响Fig.1 Effect of temperature on extraction rate

2.1.2提取时间对浸膏得率的影响

由图2可知，干膏得率总的趋势为随着提取时间的延长而逐渐增加，但随着时间的进一步延长，25 min后干膏得率的增长急剧减缓，30 min后干膏得率的增加趋向于一条平稳的直线，可见30 min后延长提取时间对干膏得率的影响较小，因此，选择20、25、30 min进行正式试验。

图2 提取时间对浸膏得率的影响Fig.2 Effect of time on extraction rate

2.1.3 料液比对浸膏得率的影响

由图3可知，随着料液比的增加，干膏得率急剧增加，但在1∶12时干膏得率达到最大值，随后呈现递减的趋势。因此，选择1∶12左右进行正交试验。

图3 料液比对浸膏得率的影响Fig.3 Effect of ratio of material to water on extraction rate

2.1.4 提取次数对浸膏得率的影响

由图4可知，随着料液比的增加，干膏得率呈现增加的趋势，但提取3次，基本已提取完全，提取次数越多，溶剂量就越大，会给后处理就带来不便。因此，选择1、2、3次进行正交试验。

图4 提取次数对浸膏得率的影响Fig.4 Effect of times on extraction rate

2.2 正交试验结果

由直观分析和方差分析结果（表2）可得，提取次数对理囊散水溶性成分的提取具有显著影响。四因素影响的主次序是：提取次数＞提取温度＞提取时间＞料液比。理囊散水溶性成分的最佳提取工艺为：A3B2C2D3，即提取温度为55℃、提取时间为25 min，料液比为1∶12，提取3次。

表2 L9（34）正交设计及结果Tab.2 The orthogonal test results and analysis

表3 方差分析Tab.3 Variance analysis of orthogonal test

2.3 验证试验结果

为了考察该工艺的优劣性和稳定性，采用优选出的最佳工艺，以干膏得率为评价指标提取3批样品，结果分别为16.56%、16.69%、16.63%，均高于正交试验中各组的值，显示此提取工艺稳定可靠。

2.4 促孕活性试验结果

2.4.1水溶性成分对小鼠子宫系数的影响试验

由表4可知，与空白对照组相比，水溶性成分中、低2个剂量组对幼鼠子宫系数无显著影响，高剂量组可明显使幼鼠子宫系数增加 （P＜0.05）。

表4 各组对雌性小鼠子宫系数的影响Tab.4 Effect on the uterine of the mice in different group

2.4.2水溶性成分对小白鼠卵巢的影响试验

由表5可知，空白组与水溶性成分高、中、低剂量组均以中、小型卵泡居多，但水溶性成分组大型卵泡的百分比均高于空白组，高剂量组中最大卵泡直径显著高于空白对照组（P＜0.05）。

表5 小鼠卵巢中各种类型卵泡百分比及最大卵泡直径Tab.5 The percentages of three typus of ovarian follicle and the max follicular Diameter

3 讨论

本实验采用超声提取法，单因素、正交试验优化中药复方理囊散的提取工艺，结果表明，超声波达到省时、高效、节能的目的［18］，该工艺简单可行，可用于理囊散中水溶性成分的提取。

用小鼠子宫增重法检测药物的雌激素活性是常用的评价雌激素作用的方法之一，其原理主要是子宫组织含有大量的雌激素受体，雌激素或具有雌激素活性的化合物通过与受体结合，可诱发细胞内的反应，使子宫组织的诱导蛋白含量增加，表现为子宫组织增生变厚而使子宫增重［19－21］。但影响雌激素效应有多种因素，为了尽量减少内源性雌激素对实验结果的影响，本实验选用了刚刚断乳性且未成熟小鼠。本实验观察了给药前后小鼠子宫系数的变化，结果显示，水溶性成分高剂量组可明显使幼鼠子宫系数增加 （P＜0.05），说明水提物有促进子宫发育的作用。

卵巢发育的程度主要由卵泡成熟的程度来判断。本实验的小鼠卵巢变化结果表明，水溶性成分组大型卵泡的百分比均高于空白组，高剂量组中最大卵泡直径显著高于空白对照组（P＜0.05），但均低于阳性对照组，说明水溶性成分组发生了类似于雌二醇组的变化，但弱于阳性对照组，提示水溶性成分提取物能促进卵巢发育，促使性成熟形态学特征提前出现。本实验确认理囊散中水溶性成分具有一定的促孕活性，可为理囊散开发成新剂型提供了理论依据。

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