正交实验法优选管花肉苁蓉酒浸炮制工艺的研究

刘雯霞，谭勇，李盈，王恒，王翔飞

（石河子大学药学院／新疆特种植物药资源重点实验室，石河子832002）

管 花 肉 苁 蓉 （Citanche tubulosa（Schenk）Wight.）为列当科肉苁蓉属多年生寄生植物的干燥带鳞叶的肉质茎，咸而温，具有补肾阳、益精血、润肠通便和延缓衰老等功能［1］。管花肉从蓉目前是肉从蓉的主要基源植物，主产于新疆南部即天山以南塔克拉玛干沙漠周围，是目前产量最大，用量最多的肉苁蓉品种［2］。宋代始载肉苁蓉有“凡使清酒浸一宿，此偏隔人心前气不散，令人上气不出”，对其炮制化学，炮制质量以及炮制工艺都有一定的研究。2010版药典中管花肉苁蓉只收载了生切片炮制品，本研究为进一步丰富新疆管花肉苁蓉的药用形式提供一定的实验支撑。

管花肉苁蓉化学成分，目前就已分离40多个化合物，其中以苯乙醇苷化合物为主要有效成分，据报道松果菊苷对抗衰老和增强记忆具有显著疗效［3－4］。酒浸法的选择是针对新疆管花肉苁蓉中苯乙醇苷类成分的结构和极性特点，由于临床应用多水煎，酒浸后能增加苯乙醇苷类成分的提取率，同时酒制能够增强补肾助阳类中药的作用，从而提高临床药效。采用正交优选和高效液相色谱相结合的方法，对能够影响管花肉苁蓉的炮制的因素如饮片规格，酒的种类，酒润时间进行优化，探讨该工艺对管花肉苁蓉中苯乙醇苷类成分松果菊苷含量的影响，从而验证新疆管花肉苁蓉酒浸法炮制工艺的科学性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1仪器

HPLC岛津LC－20AT高效液相色谱仪（日本导津公司）；CBM－10A 型色谱工作站；SPD－10A型紫外检测器（日本导津公司）；PLATISILTM ODS（5μL，4.6×250 mm）色谱柱；万分之一天平（赛多利斯）；超声提取仪（济宁天华）。

1.1.2样品与试剂

管花肉苁蓉药材购自和田天力沙生药物开发有限责任公司，经石河子大学药学院中药系副教授谭勇鉴定为管花肉苁蓉（Citanche tubulosa（Schenk）Wight.）的干燥带鳞叶的肉质茎；松果菊苷标准品（购自中国药品生物制品检定所，批号111670－200503）；乙腈和甲醇（色谱纯，江阴精细化工研究所），蒸馏水（三蒸），冰醋酸（分析纯，南京化学工业公司）；白酒（酒精度数50°，塔城市剑城春酒业有限责任公司），黄酒（酒精度数20°，绍兴糯米老酒），米酒（酒精度数10°，广东鹤山市桃源跃马酒厂）。

1.2 方法

1.2.1正交实验

取净制的新疆肉苁蓉切片，厚度2、4、6 mm的饮片各50 g。取加工切制不同规格的肉苁蓉各10 g，干燥后按表1设计的因素水平进行正交实验，其中药料比为100∶30。炮制品采用60℃温度烘干，中途翻动1～2次，取出后放凉研成粉末备用（表1）。

表1 因素水平表Tab.1 Factor and level

1.2.2松果菊苷含量测定

1.2.2.1 色谱条件 色谱柱：PLATISILTMODS（5μL，4.6×250 mm）；流动相：甲醇－乙腈－1%醋酸溶液 （15∶10∶75）；流速0.80 m L／min。检测器参数：检测波长：334 nm；柱温：30℃。

1.2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取在60℃真空干燥至恒重的松果菊苷对照品2.0 mg，置10 m L容量瓶中，加60%甲醇溶解并定容，即得0.20 mg／m L对照品储备液。

1.2.2.3 供试品溶液的制备 管花肉苁蓉各炮制品分别粉碎过6号筛，干燥至恒重，分别精密称取药材粉末0.5 g置于锥形瓶中，加50%甲醇25 m L，称定重量，浸润30 min，超声提取40 min，放冷，称定重量，加50%甲醇补足重量，摇匀，0.22μm滤膜滤过。以峰面积计算松果菊苷含量。

1.2.2.4 标准曲线的制备 将松果菊苷对照品贮备液稀释至0.02 mg／m L，精密吸取2.5、5、7.5、10、12.5、15μL进样，按上述色谱条件测定。以峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X）为横坐标，制作标准曲线，得到回归方程Y＝465494 X －64289，R2＝0.9999，线性范围0.05～0.3μg，结果表明在此范围内存在良好的线性关系。

1.2.2.5 精密度实验 精密吸取松果菊苷对照品溶液，按照上述色谱条件，重复进样，测得峰面积，计算RSD为1.75%（n＝6）。

1.2.2.6 稳定性实验 精密吸取同一浓度的样品溶液，按照上述色谱条件，在24小时内每隔4 h测定一次，记录峰面积，结果显示松果菊苷峰面积的RSD＝1.75%（n＝6）。

1.2.2.7 重复性实验 精密称取管花肉苁蓉生品粉末1.0 g，平行6份，按“1.2.2.3”制备供试品溶液，以外标法计算松果菊苷的含量（%），计算测定结果的RSD为2.78%（n＝6）。

1.2.2.8 加样回收率实验 取已知含量的管花肉苁蓉药材粉末1.0 g，平行6份，分别精密加入松果菊苷对照品，按"1.2.2.3"制备供试品溶液，计算加样回收率，结果见表2，松果菊苷平均回收率为97.5%。

表2 加样回收率试验结果 n＝6Tab.2 Recovery test

2 结果与分析

2.1 样品的含量测定及结果分析

按照“1.2.2.3”项下方法和“1.2.2.1”项下的测定条件，对各酒浸样品进行含量测定，结果及分析见图1、图2及表3、表4。

图1 松果菊苷对照品Fig.1 Echinacoside

图2 管花肉苁蓉生品Fig.2 Citanche tubulosa （ Schenk）wigh

表3 管花肉苁蓉松果菊苷含量正交试验结果Tab.3 Orthogonal Experiment Result of Citanche tubulosa（Schenk）Wight

表4 方差分析表Tab.4 Variance analysis

注：F0.01（2，2）＝99.0，F0.05（2，2）＝19.0。

直观分析结果表明，三因素中B因素即酒的种类对实验结果影响最大，为管花肉苁蓉酒浸工艺的主要影响因素，酒润时间C为次要因素，各因素对管花肉苁蓉松果菊苷含量的影响结果依次为B＞C＞A。进一步的方差分析说明（结果见表4），只有因素C对管花肉苁蓉松果菊苷的含量有显著性的影响，综合分析，在管花肉苁蓉酒炒炮制工艺中，最佳工艺条件为A1B3C3，即饮片规格厚度为6 mm的净药米酒浸制120 min。

2.2 验证实验

为确证该工艺的稳定性，在上述正交实验的基础上，按筛选的最佳工艺条件，进行了重复验证实验。称取净制的管花肉苁蓉20 g，按照以上最优工艺参数进行3次实验，结果松果菊苷平均含量为1.97%（RSD＝1.80%），表明优选工艺切实可行。

2.3 水煎液中松果菊苷含量测定

中药饮片多为水煎使用，故实验对水煎液中松果菊苷含量测定，进一步印证该方法的可行性。取“2.2”项下样品，分别精密称取各粗粉2.0 g，加水20.0 m L，称重，混匀，煎煮60 min，放置过夜，称重，加水补足重量，滤过，弃去初滤液，收集续滤液10.0 m L，续滤液于水浴上蒸干，以甲醇溶解，充分洗涤，定容于2 m L量瓶中，以峰面积计算松果菊苷含量。结果见表5。

表5 生品与炮制品管花肉苁蓉水煎液松果菊苷含量比较Tab.5 Comparison of the echinacoside contents between the raw and treated Citanche tubulosa（Schenk）

结果表明新疆管花肉苁蓉水煎液中松果菊苷含量低于醇提液，同时生品和炮制品水煎液的松果菊苷含量比较，炮制品较生品有一定的提高，可见该炮制方法对于临床饮片使用有一定的意义。

3 讨论与结论

现代研究中陈妙华形成了加黄酒常压炖的方法最佳［5］。炮制质量研究，采用高效液相色谱法对肉苁蓉生品及不同炮制品中麦角甾苷的含量进行比较研究。结果表明炮制是麦角甾苷的含量降低，高压处理则降低更多［6］。本研究对酒浸工艺进行实验研究，结果表明，辅料酒对松果菊苷含量影响有一定的差别，其中白酒浸后含量最低平均含量为1.43%，其次为黄酒浸含量为1.502%，含量最高的为米酒平均含量为1.732%。本工艺比传统辅料黄酒或白酒含量略高，其机理还有待于进一步深入研究。

已有研究报道［7－8］，选用334 nm 检测松果菊苷的波长，以甲醇－乙腈－1%醋酸溶液（15∶10∶75）为流动相。本试验通过紫外扫描，确定在334nm有明显吸收峰，流动相以甲醇－乙腈－1%醋酸溶液（15∶10∶75）为流动相，考虑到高浓度酸对色谱柱损坏较严重，故减低其比例，发现不同程度的出现了拖尾现象，故仍选择甲醇－乙腈－1%醋酸溶液（15∶10∶75）为流动相。对超声和回流两种提取方法进行考察，发现超声提取有效成分提取率高，并且操作简便快捷。提取溶剂选择分别设置了纯甲醇，90%甲醇，70%甲醇，50%甲醇和30%甲醇，结果50%甲醇提取率更高，故定位50%作为提取溶剂。提取时间考察考虑到松果菊苷的不稳定性，长时间超声提取会提高水温，因此一定程度上会影响到松果菊苷的含量，因此时间分别考察了20 min，30 min，40 min和60 min，结果表明最佳提取时间是40 min。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.2010年版一部.北京：化学工业出版社，2010：126.

［2］陈敏，肖苏萍，崔光红，等.管花肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量测定［J］.中国中药杂志，2005，30（11）：839－841.

［3］雷丽，宋志宏，屠鹏飞，等.肉苁蓉属植物的化学成分研究进展［J］.中草药，2003，34（5）：473.

［4］吴波，付玉梅.肉苁蓉多糖对衰老小鼠脂质过氧化的影响［J］.广州医学院学报，2004，32（4）：27－28.

［5］陈妙华.肉苁蓉最佳炮制方法的筛选［J］.中药材，1996，19（10）：508.

［6］张思巨.肉苁蓉生品及不同炮制品麦角甾苷含量比较研究［J］.中国药学杂志，1996，31（6）：335.

［7］张思巨，刘丽，于江永，等.HPLC法测定肉苁蓉药材中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量［J］.中国药学杂志，2004，39（10）：741－742.

［8］李鑫，堵年生.RP－HPLC法测定不同寄主和不同产地肉苁蓉中松果菊苷和麦角甾苷的含量［J］.药物分析杂志，2003，23（4）：254－255.