干细胞治疗技术在犬中的应用进展

高一龙 温 海 张汇东

干细胞治疗技术在犬中的应用进展

高一龙 温 海 张汇东

干细胞(Stem Cells)是一种未充分分化，尚不成熟的，具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下它可以分化成多种功能细胞，是机体的起源细胞，是形成机体各个组织器官的“祖宗细胞”，具备再生各种组织器官的潜在功能，医学界称之为“万用细胞”。根据干细胞所处的发育阶段，可分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。目前，干细胞技术的研究主要集中于疾病治疗、再生医学和克隆等方向。

虽然大部分的干细胞研究都是针对人类医疗上的需求，但因为伴侣动物（犬）身体的构造及疾病（尤其是遗传病）与人类相似，所以常被当成干细胞研究上的主要常用实验（模式）动物，这也使得干细胞治疗在小动物临床上有惊人的进展。

干细胞治疗脊髓 损伤

韩国建国大学兽医学院教授金辉、研究员Jeong Uk-heon研究小组（2009）曾利用人类脐带血间质干细胞(hUCB-MSCs)成功治愈了脊髓受伤导致两条后腿瘫痪的犬:对瘫痪的犬注入脐带血干细胞，3周后开始出现恢复迹象，8周后四肢的运动能力恢复到正常水平，甚至还可以跳。据悉，研究小组已经在国际学术杂志《脊髓神经外科(Journal of Neurosurgery Spine)》上发表了这项研究结果。 此前，学界曾有过关于利用从人骨髓或脂肪提取的干细胞治疗犬脊髓损伤的报告，但利用脐带血干细胞成功治愈，这还是第一次。注入到犬体内的干细胞不断分化，制造出脊髓内消失的神经细胞，使脊髓损伤恢复到正常水平。

随后，该研究小组对基于人脐带血间质干细胞(hUCB-MSCs)治疗脊髓损伤(SCI) 的疗法又进一步实验评估和验证，并观察了该疗法对脊髓损伤犬的长期影响。他们采用了10头脊髓受伤的犬作为研究对象，7头在脊髓损伤一星期后移植hUCB-MSCs，而剩下的3头犬没有移植。其中2头移植hUCB-MSCs的犬，一个月后死亡，死于移植后造成的泌尿道感染、褥疮和败血症；3头没有移植hUCB-MSCs 的SCI犬从3个月到1年这段观察期间其运动和感觉功能并没有改善，且他们的泌尿功能障碍一直持续到被实施安乐死；而另外5头移植hUCB-MSCs的犬中有4头犬后腿功能得到显著恢复，这4头犬的运动和感觉功能在移植后3年逐渐恢复。研究结果表明，移植人脐带血间质干细胞治疗脊髓损伤犬有积极的治疗效果，组织学检查显示，人脐带血间质干细胞能够显著提高脊髓损伤犬的髓鞘再生能力。

另外，印度兽医泰米尔纳德邦和动物科学学院也曾应用自体干细胞疗法，对一头3岁脊髓损伤的犬开展这项实验，帮助犬从脊髓损伤中恢复（2009）。

干细胞治疗进行性肌营养不良症

进行性肌营养不良（progressive muscular dystrophy， PMD）是一组X染色体连锁隐性遗传病，患者的肌肉细胞会呈进行性的退化萎缩直至死亡。其中最典型也最严重的叫杜氏（Duchenne）进行性肌营养不良，此病是由于患者肌肉细胞中抗肌萎缩蛋白基因的突变造成，使得患者瘫痪或过早的死亡。

犬的进行性肌营养不良症状与患PMD的人类极其类似，意大利米兰San Raffaele研究院的Giulio Cossu研究团队于2006年在《自然》杂志发表了一项研究报告：他们应用干细胞技术对罹患肌肉萎缩症(肌营养不良症)的黄金猎犬进行治疗，已取得重大实验成效，患病犬头肌力显著增强，可以像健康犬一样跑跳。该项实验成果可能预示着对治疗人类危害极大的杜氏进行性肌营养不良（渐冻症）具有积极意义。

Cossu教授领导的研究团队首先从健康犬的肌肉血管中取出mesoangioblast干细胞，在实验室中将其扩增培养到足够数量，然后在5个月时间里分批次陆续将数千万个mesoangioblast干细胞注射到罹患杜显氏肌肉萎缩症的犬血管内；这些犬的免疫系统在实验前已受到抑制以免产生排斥。患有进行性肌营养不良的黄金猎犬通常在8个月大时，行走就会产生困难，而这些经过干细胞治疗的患犬行走能力要强得多，有一头经过干细胞治疗的黄金猎犬甚至在13个月大时，还能行走。

研究者对经干细胞治疗的患病实验犬肌肉组织进行检测，发现这些mesoangioblast干细胞通过血液转移，然后从毛细血管慢慢扩散到实验犬全身的肌肉组织中，这些mesoangioblast干细胞与肌肉组织中原先存在的肌肉纤维融合，产生了肌肉细胞中原先不存在的抗肌萎缩蛋白，并使得原先的肌肉纤维更新。但是，如果用来自正常供体犬的干细胞进行移植这种方法来治疗杜氏进行性肌营养不良的患者，效果并不完美，因为这样被治疗的患犬，需要终身服用抗排异药物来防止发生排异反应。

所以，这项实验的下一步是尝试修正患病犬的自体细胞，以使这些犬无需继续施打抗排斥药物。Cossu研究团队试图寻找到解决这一问题的方法，他们从患有进行性肌营养不良的实验犬的血管中采集mesoangioblast干细胞，因为，这些实验犬的mesoangioblast干细胞同样缺失抗肌萎缩蛋白基因，所以研究者用慢病毒载体将外源的抗肌萎缩蛋白插入患病实验犬的mesoangioblast干细胞的细胞核，然后再将这些经过修复的mesoangioblast干细胞回注到实验犬的体内。这些被移植了经过修复后的自体mesoangioblast干细胞的患病犬的肌肉细胞中产生了抗肌萎缩蛋白，但是它们的症状没有得到改善。Cossu分析可能是因为用了截短的抗肌萎缩蛋白，所以没有能改善这些实验犬的症状。抗肌萎缩蛋白基因是人类基因组中最大的一个基因，长度达到250万个碱基对，无法载入较安全的相关病毒载体，这是目前全世界的科学家用基因治疗的方法治疗杜氏进行性肌营养不良的遇到的首要难题。若要解决这一问题，可能需要用不同版本的抗肌萎缩蛋白，插入这些患病犬的mesoangioblast干细胞。

长期来看，如果这种自体干细胞移植疗法行得通，患者就可以不用终身服用免疫抑制剂。而目前如果不服用免疫抑制剂，这些受试犬在接受健康犬的干细胞后，将会很快再次丧失行走能力。Cossu教授已计划进行临床试验，初步做法将采用已在患病犬身上获得成效的方法，亦即使用从捐赠者身上取得的干细胞。他预测若要让肌肉萎缩的病患移植经基因修正的自体干细胞，还得需要几年时间。

干细胞治疗骨关节损伤

赛马和赛犬等竞技动物，因为经常比赛会发生严重的骨关节损伤，这也使得兽医在外科手术的同时，积极寻求应用干细胞技术方法非损伤性治疗骨关节疾病的方法。鉴于间质干细胞能够分化成骨、软骨、肌腱和韧带的组成细胞（以及肌肉，脂肪，可能还有其它组织），有科学家试图研究利用成年来源的间质干细胞，来治疗动物骨头、软骨、韧带、及肌腱上的这些组织的损伤或缺损疾病。间质干细胞主要来源于脂肪组织或骨髓，由于异体间质干细胞的接种可能会造成排斥，所以间质干细胞通常是采取自体移植的方式。但在一些研究犬及马的骨折修复手术中，所采用的间质干细胞并没有诱发免疫排斥反应，相反的此类问质干细胞可以促进骨折处的骨组织再生。已有相关的文献证实，可以利用脂肪组织或骨髓来源的干细胞来治疗肌腱和韧带受伤的马匹。

干细胞技术克隆犬

韩国干细胞治疗技术研究公司RNL Bio 2009年1月29日称，该公司和首尔国立大学合作以取自犬脂肪组织的干细胞成功克隆了两头黑色小犬，这是全球首例使用干细胞技术克隆犬。此前，英国、日本、美国和新西兰的科学家都曾成功用干细胞克隆出绵羊、猪、老鼠和鹿。2005年，首尔国立大学成功利用普通皮肤细胞制造了全球第一头克隆犬“首努比”（阿富汗猎犬）。应用干细胞技术成功克隆犬类动物这还是第一次，首尔国立大学克隆项目的负责人李秉川认为在基因研究领域，干细胞比普通细胞更有优势。

RNL Bio公司的负责人罗郑赞称，公司计划对干细胞克隆技术进行商业推广。应用该技术，宠物犬的主人就可以事先储存犬的干细胞，等到爱犬生病时可以使用干细胞给犬治病，甚至在犬去世后，还可以利用干细胞克隆一模一样的犬。

结 语

干细胞治疗技术作为一种新型的疾病治疗手段，它克服了临床常规治疗的局限性，为动物和人类疾病的治疗打开了全新的思路，展示出广阔的应用前景，干细胞治疗技术在组织工程领域得到了广泛应用。可以预想，在不远的将来，开展干细胞的研究，定向培养与生产犬的各种组织器官，可以为因执行任务受枪伤、刀伤或生病的警犬，进行器官移植，对保持和恢复警犬的战斗力大有益处。

但是干细胞治疗是目前最复杂的生物疗法，有许多的技术难点尚未突破，其确切的疗效和安全性有待验证，尚不能在临床上广泛应用。干细胞治疗技术的操作标准、产品质量控制等问题也需进一步规范。

（作者单位：公安部南京警犬研究所，210012）

（编辑：李 冰）