复方南星止痛膏的顶空气相色谱指纹图谱研究

李永辉，王佩香，陈俊，赵丽，丁岗，萧伟*

（1.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001；2.海南医学院药学院，海南 海口 571101）

中药工业

复方南星止痛膏的顶空气相色谱指纹图谱研究

李永辉1，2，王佩香1，陈俊1，赵丽1，丁岗1，萧伟1*

（1.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001；2.海南医学院药学院，海南 海口 571101）

目的：建立复方南星止痛膏的顶空气相指纹图谱，全面评价其质量。方法：采用气相色谱法，色谱柱：HP-5MS（30 m×0.25mm，0.25μm），载气为氮气，流速：1mL·min－1，分流比：5∶1，FID检测器，程序升温，顶空进样。并对10批复方南星止痛膏挥发性成分指纹图谱进行相似度计算。结果：10批复方南星止痛膏指纹图谱中有6个共有峰，各峰分离度良好，样品间相似度均大于0.95。结论：本方法简便、准确、重现性好，可用于复方南星止痛膏的质量评价。

复方南星止痛膏；气相色谱；指纹图谱

复方南星止痛膏是由肉桂、丁香、冰片、樟脑等12味药材组成的中药复方制剂，具有散寒除湿，活血止痛的功效。用于治疗寒湿瘀阻所致的关节疼痛，肿胀，活动不利，遇寒加重等［1］。该制剂为江苏南星药业有限责任公司产品（国药准字Z10970019），目前复方南星止痛膏质量标准仅有含量测定研究，未对其制剂进行指纹图谱研究［2］。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性，以指纹图谱作为中药制剂的质量控制方法，已成为目前行业的共识［3-5］。考虑到制剂中含有大量的挥发性药材，采用气相色谱进行了复方南星止痛膏的指纹图谱研究，该方法简便、准确、专属性强、重现性好，能有效地控制该制剂的质量。

1 仪器与试剂

Agilent6890系列GC色谱仪，含7694E顶空进样系统、柱温箱、FID检测器等单元。安捷伦HP-5MS柱（30 m×0.25mm，0.25μm），樟脑对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110747-200507，供含量测定用）；复方南星止痛膏（江苏南星药业有限责任公司，批号100416，100417，100418，100419，100420，100421，100422，100423，100424，100425，分别编号S1～S10）。甲醇、甲基硅油均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

顶空条件：样品加热温度120℃，定量环温度135℃，传输线温度150℃；样品加热时间40 min，加压时间0.2 min，定量环填充时间0.5 min，定量环平衡时间0.05 min，进样时间1.0 min。

色谱条件：程序升温起始温度为100℃，保持3 min，以2℃·min－1的速率升至130℃，以30℃·min－1的速率升至230℃，保持2 min。流速：1mL·min－1；分流比：5∶1；FID检测；记录时间：20 min。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取樟脑对照品适量，加甲醇制成浓度为1 mg·mL－1的溶液，即得参照物储备液。精密吸取80μL参照物储备液，置20mL顶空进样瓶中，加入200 mg甲基硅油，压盖密封，80℃加热10 min，超声混匀，作为参照物样品。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取复方南星止痛膏5 mg，置20mL顶空进样瓶中，加入200mg甲基硅油，压盖密封，80℃加热10 min，超声混匀，作为供试样品。

2.4 测定方法

分别精密量取对照品溶液和供试品溶液适量，注入气相色谱仪，按上述色谱条件操作，考察80 min内供试品溶液的色谱分离情况，记录20 min色谱图。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 按照2.3供试品溶液的制备项下方法制备样品，按照2.1项下色谱条件连续进样5针，记录色谱图，以樟脑为参照峰，计算共有峰相对保留时间及相对面积，结果各峰相对保留时间RSD均小于0.03%；相对峰面积 RSD均小于3.72%，表明仪器精密度符合要求。

2.5.2 稳定性试验 取批号为100416的复方南星止痛膏，按2.3供试品溶液的制备项下方法制备供试品，分别于0，2，4，6，8 h进样考察其稳定性，以樟脑为参照峰，计算共有峰相对保留时间及相对面积，结果各峰相对保留时间RSD均小于0.09%；相对峰面积RSD均小于3.55%，结果表明供试品样品在8 h内稳定。

2.5.3 重复性试验 取批号为100416的复方南星止痛膏，按2.3供试品溶液的制备项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.1项下色谱条件分别进行分析，以樟脑为参照峰，计算共有峰相对保留时间及相对面积，结果各峰相对保留时间RSD均小于0.12%；相对峰面积RSD均小于4.24%，结果表明本试验方法的重复性符合要求。

2.6 指纹图谱的建立［6］

2.6.1 共有指纹峰的标定 采用相对保留时间标定共有指纹峰，以图谱中樟脑色谱峰为参照峰（S），将各色谱峰保留时间与同一图谱中参照峰的保留时间比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间，计算10批样品指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间，见表1。其中6个色谱峰为各样品所共有，故标定它们为共有指纹峰。

表1 共有指纹峰的保留时间

2.6.2 共有峰的相对峰面积 以图谱中樟脑峰（2号峰）为参照峰，将各色谱峰峰面积与同一图谱参照峰的峰面积比较，其比值为各色谱峰的相对峰面积。见表2。

2.6.3 指纹图谱相似度评价 采用中国药典委员会出版的《中药色谱指纹图谱相似度评价》软件（2004年 A版）进行相似度计算。设置批号为100416的样品图谱为参照图谱，对照图谱生成方法采用中位数法，时间窗宽度为0.10，多点校正后自动匹配，生成对照指纹图谱（S），见图1～2。结果10批制剂的相似度均在0.99以上，表明建立的指纹图谱的技术稳定、重现性好。见表3。

2.6.4 主要GC色谱峰的确认 运用对照品对比和GC-MS的分析方法，对2，3，4号主要色谱峰进行了指认，结果显示3个化合物分别为樟脑、异龙脑和龙脑，其质谱碎片分别为樟脑（152，108，95，81，69，55），异龙脑（136，121，110，96，82，67，55）和龙脑（139，121，110，96，91，67，55）。

图1 10批复方南星止痛膏GC指纹图谱

图2 复方南星止痛膏的对照指纹图谱

表3 相似度计算结果

3 结果与讨论

3.1 色谱柱的选择

在实验过程中考察了HP-INWAX色谱柱和HP-5MS柱，HP-INWAX柱对龙脑和异龙脑的分析效果较好，但是其他色谱峰数小于HP-5MS柱。综合考虑，所以本文选择了HP-5MS柱进行指纹图谱研究。

3.2 顶空溶剂的选择

本实验尝试了正丁醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、水分别作为复方南星止痛膏的溶剂，结果正丁醇、二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺的溶剂峰较高，水为溶剂的信号峰较小。而采用高沸点的甲基硅油为溶剂，可以有效减少溶剂峰的气化，同时随着温度上升，样品峰的峰面积也增加较多，各组分能够良好分离，色谱图包含的色谱峰信息多。

3.3 顶空加热温度和时间的选择

确定甲基硅油为顶空溶剂后，我们对加热温度分别选择了100，120，140，160℃，加热时间选择20，40，60 min进行了考察。结果显示加热温度超过120℃时，峰面积增加较少，但仪器精密度偏差大于10%，因此我们选择了120℃作为加热温度。加热时间考察结果显示，加热40 min后，峰面积不再有显著的增加，所以选择加热时间为40 min。

3.4 其他

10批复方南星止痛膏的相似度均超过0.95，说明复方南星止痛膏的生产工艺较稳定。该方法可以用于复方南星止痛膏的质量控制。然而在指纹图谱相似度计算中使用的是相对峰面积比值，相似性代表的是图谱中对应峰比例的一致性，基本不受整体浓度的影响，因此评价药材、中间体和制剂的质量时，还应该参考质量标准中的含量测定项。

［1］谈莹莹.复方南星止痛膏外治膝骨关节炎寒湿痹阻证的临床示范性研究［D］.南京：南京中医药大学，2010.

［2］殷书梅，王宓，林新艳，等.UPLC法测定复方南星止痛膏中马兜铃酸A的含量［J］.南京中医药大学学报，2009，25（5）：396-397.

［3］刘小花，沈孝丽，石义凯，等.参橘止咳滴丸的指纹图谱研究［J］.现代中药研究与实践，2012，26（1）：75-78.

［4］颜月园，萧 伟，吴云，等.散结镇痛胶囊中皂苷类成分的指纹图谱研究［J］.中草药，2012，43（3）：496-500.

［5］陈华，李岚，陈小荣，等.健胃消食片HPLC指纹图谱研究［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（5）：79-82.

［6］国家食品药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）［S］.2000.

Fingerprint Chromatogram Analysis of Fufang Nanxing Zhitong Gao by Headspace GC

LIYong-hui，WANG Pei-xiang，CHEN Jun，ZHAO Li，DING Gang，XIAOWei
（1.Jangsu Kanion Pharmaceutical Co.，Ltd.，Lianyungang 222001，China；2.School of Pharmacy，Hainan Medical University，Haikou 571101，China）

Objective：To establish a headspace GC fingerprint chromatogram for analysis volatile compounds of Fufang Nanxing Zhitong Gao，and evaluated its quality.MethodsThe sample was conducted by GC with HP-5 column（30 m×0.25mm，0.25μm）.The carrier gas was N2at the flow rate of 1.0mL·min－1.Split ratio was 5∶1.The detection was FID.Ten batches of Fufang Nanxing Zhitong Gao was calculated to their similarity.Results：Six main peakswere clearly separated in 20 min.The similarity of ten batches was over 0.95.Conclusion：The headspace GC fingerprint chromatogram is successfully used on analysis and quality control of Fufang Nanxing Zhitong Gao.

Fufang Nanxing Zhitong Gao；GC；Fingerprint

* ［通讯作者］萧伟，E-mail：kanionxw2010＠126.com

2012-05-18）