高效液相色谱－库仑电化学法在维生素A、E联合检测中的应用

张晓红，呼 竞，华正德，关 磊

（哈尔滨市妇幼保健院，黑龙江 哈尔滨150070）

维生素A是脂溶性维生素，亦名视黄醇，是体内维持正常视觉、促进生长发育、维持上皮完整、维持正常免疫功能以及增强机体抗感染能力的重要物质。其缺乏会损害儿童免疫功能，增加儿童死亡率。维生素A缺乏病是WHO公认的四大营养缺乏病之一，发展中国家因维生素A缺乏引起干眼病而致盲的患者高达1000万以上，目前仍是不发达国家中威胁人类健康、尤其是儿童的主要疾病。“世界儿童问题首脑会议”及“90年代中国儿童发展规划纲要”，将消除维生素A缺乏作为2000年战略目标之一。维生素E（Vitamin E）也是脂溶性维生素，又称生育酚，是维持机体正常代谢和机能的必需维生素。生育酚能促进性激素分泌，使男性精子活力和数量增加；使女性雌性激素浓度增高，提高生育能力，预防流产，还可用于防治男性不育症、在抗氧化、抗自由基、提高免疫功能、抗衰老、抗癌变等过程中发挥着重要作用，缺乏时会引起心、肝和肌肉退化以及不生育、习惯性流产、脱发、肌营养失调、中枢神经系统变化和贫血等。故及时了解血液中维生素A、E的含量对临床预防、诊断、治疗有重要意义。本文在以往工作基础上，改良了检测条件，建立了高效液相色谱－库仑电化学同时检测人血清中维生素A、E含量的方法，灵敏度高，准确性好，回收率和重复性好，操作简便、快速、结果可靠。

1 材料和方法

1.1 原理 用乙醇沉淀蛋白质，用己烷萃取维生素A、E，残留物用乙醇重新溶解，这些化合物用C18柱通过反相液相色谱法来分离，用库仑阵列电化学来检测。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 美国ESA的高效液相色谱－库仑电化学检测分析系统，542自动进样器（含制冷）；582型泵两台（梯度泵）；控温元件箱。

1.2.2 试剂 标准品由Sigma公司提供，利用无水乙醇等试剂配制成从低到高5个不同浓度的混合标液，标液中含有一定量的维生素A、E及内标物维生素A醋酸盐。

1.2.3 色 谱 条 件 色 谱 柱：ESA MD－150C18 Column（150mm×3.0mm，3μm）。检测电压：各通道电压（mv）：200、400、550、800。

1.3 样品处理

1.3.1 样品采集 采集受检者静脉血或末梢血（适用于3岁以下儿童），离心后提取100μl血浆或血清。1.3.2 对样品进行前处理 将100μl血浆或血清，利用化学试剂沉淀蛋白后萃取维生素A、E，并用氮气将移出物吹成干燥状态，残留物用100μl ETOH／BHA液重新溶解等待测定。

1.4 测定

1.4.1 标准曲线的制作 按上述条件，采用内标法，用4个标准溶液的峰面积绘制标准曲线。

1.4.2 样品测定 取处理好的样品10μl进样，按上述条件进行分析，获得图谱，对照标准曲线进行定量。

1.5 质量控制 收集正常人20份血清（或血浆）足量，加入200μg／dl、1 000μg／dl的标准溶液，采用双水平质控，取得有效数据作为质量控制使用。

2 结果

2.1 色谱图 维生素A、E检测的样品图见图1。

2.2 线性范围和检出限 配置不同浓度维生素A、E标准溶液，按标准曲线步骤进行测定，根据3倍基线噪声所对应的维生素浓度计算方法的最低检出限。

2.2.1 线性检测 对维生素A、E标液进行倍比稀释，等体积进样，以每种维生素浓度的峰面积作图，测出最低检测限及线性回归方程。见表1。

2.3 标准溶液的稳定性 配置同一浓度的标准溶液，连续5天进行测定，以峰面积的相对标准偏差观察维生素E、A标准溶液的稳定性，实验结果见表2、表3。结果表明，不同浓度的维生素A、E标准溶液在－20℃比较稳定，建议每周进行一次标准溶液的配置。表1 样品线性范围和检出限

图1 维生素A、E检测色谱图结果

项目 线性范围 （μg／L） 线性方程 相关系数 最低检测限（μg／L）＋0.003051 0.9952 0.052 VA 0.068－200 Y＝0.003984 X VE 0.112－2000 Y＝0.001689 X＋0.0001761 0.9997 0.038

表2 VE标准溶液的稳定性

VE浓度（μg／L）VE检测的峰面积（微库仑：μC）第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 R SD（%）2000 3.79 3.74 3.69 3.66 3.61 1.90 4000 7.39 7.35 7.17 7.19 7.11 1.68 10000 17.0 16.7 16.3 16.5 15.9 2.52 20000 30.2 29.1 28.9 28.7 28.0 2.75

表3 VA标准溶液的稳定性

2.4 精密度实验 对同一标准溶液连续测定7次，以峰面积的RSD观察精密度，维生素E、A的RSD分别为1.91%、2.9%，实验结果见表4。

表4 VE精密度实验

2.5 回收实验 取3份血清样本，加入3个浓度水平的标准溶液，进行加标回收实验（n＝3），维生素E、A平均回收率分别在90%－111%、93%－102%，结果见表5、表6。

表5 维生素E加标回收率结果

表6 维生素A加标回收率结果

3 方法应用

用本方法分别同时测定了6岁以下儿童血清／血浆维生素A、E样品120份；孕妇血清／血浆维生素A、E样品90份。

结果表明血清中儿童维生素A的检测范围为26－51μg／L，孕妇维生素 A的检测范围为34－56μg／L，孕妇与儿童的维生素A水平有显著差异，P＜0.01；6岁以下儿童维生素E的检测范围为342－1410μg／L，孕妇维生素E的检测范围为375－1731 μg／L，孕妇与儿童的维生素E水平无显著差异，P＞0.01。

4 讨论

4.1 检测器的选择 该系统采用电化学检测器，比二极管检测器数值定性灵敏度高1000倍，穿透式电极，实现了样品100%的反应，没有信号损失。自动进样器，可精确进样最小至1μl，并含有样品盘冷却装置，保证了热稳定性差、易分解的维生素A、E在分析过程中无样品损失。

4.2 高压梯度泵的应用 通过连续不断地调整A、B流动相的配比，改善分离条件，提高分离效果，缩短分析时间。

4.3 流动相的选择 由于维生素A、E为脂溶性维生素，故本法选择以甲醇为主的流动相洗脱液。流动相为甲醇、水、正丙醇、磷酸盐缓冲溶液按比例配成。

4.4 流速的选择 改变流速不仅可以改变保留时间，同时对灵敏度也有一定的影响。实验证明，在0.8ml／min时，维生素A、E的峰面积达最大值。

4.5 色谱柱的选择 鉴于HPLC法一般使用C8、C18柱，比较了C8、C18柱的分离效果，发现应用C18 3μm的柱子将维生素A、E很好地分离，且峰形好。

4.6 样品的选择 通过反复实验论证了采集末梢血，同时检测维生素A、E的目的。

4.6.1 样品的前处理 实验表明，连续2次加入450μl正己烷进行二次萃取可达到分析要求。萃取时，漩涡混匀的力度和时间应尽量一致，否则影响提取效率和精密度。

4.6.2 样品的浓缩 用氮气吹干萃取液时，氮气流量应尽量小，以防待测物质的损失。溶解残渣时加入的乙醇量应准确，否则影响待测物浓度。

4.7 暗室的应用 为了避免样品见光分解，样品处理过程需在暗处。

4.8 我院引进的高效液相色谱－库仑电化学分析系统，其灵敏度高，准确性好，对维生素A、E分析结果表明，此检测方法操作简单、可靠；是目前维生素A、E检测的最佳方法。

4.9 运用高效液相色谱－库仑电化学分析系统开展维生素A、E的联合检测，达到了一次采血可同时准确分析体内维生素A、E的含量。末梢血的采用极大方便了儿童，有利于此项工作在广大基层开展。改变目前滥用维生素制剂的现象，达到合理用药的目的，极大的降低了由于维生素A、E缺乏或中毒引起相关疾病的治疗费用。

［1］刘雪平.高效液相色谱－库仑电化学检测法对多种脂溶性维生素及营养物质的分析［J］.中国卫生检验杂志，2003，13（5）：597.

［2］郑妹凤.反相高效液相色谱法同时测定儿童血清中维生素A、E含量的研究［J］.安徽预防医学杂志，2008，14（3）：110.

［3］李影林主编.中华医学检验全书［M］.北京：人民卫生出版社，1997：157－162.

［4］李静娜.二极管陈列反相高效液相色谱法测定人血清中维生素E含量［J］.中国卫生检验杂志，2008，18（2）：2.