VDR基因多态性与宁夏回汉族白癜风患者的相关性研究

郭 睿，郝雁杰，汪京峡，刘 霞，杨文斌

（1.宁夏医科大学，宁夏 银川750004；2.宁夏回族自治区人民医院 皮肤科；3.宁夏医科大学总医院 皮肤科）

白癜风是一种常见的色素脱失性疾病，其白斑可发生在身体任何部位，但因病因复杂，目前尚无满意的治疗方法，因白斑多发在暴露部位，患者生活质量受到影响。近年来，国内外许多文献研究了维生素D受体（Vitamin D Recepter VDR）与自身免疫性疾病的关系，1，25－二羟胆骨化醇［1，25（OH）2D3］是维生素D的活性形式，介导VDR发挥与免疫性疾病 有 关 的 生 物 学 效 应［1］。近 年 发 现 1，25（OH）2D3和类似物通过VDR影响黑素生成，调节机体的免疫功能［2］，从而与白癜风的发病有一定的相关性，也有研究表明白癜风患者存在VDR的低表达，而且发现维生素D衍生物对白癜风具有治疗作用［3］。本文运用聚合酶链式反应－限制性内切酶片段长度多态性（PCR－RFLP）技术检测宁夏地区回汉族白癜风患者与正常对照组中VDR基因FokI、BsmI位点的频率分布，以分析VDR与回汉族白癜风患者发病的相关性，更重要的是为维生素D治疗白癜风患者提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象 来自本院2008年3月至2011年3月皮肤科门诊参照文献［4］确诊的寻常型白癜风患者251例，其中汉族136例，回族115例，男性130人，女性121人，年龄3岁－75岁。正常对照组来自本院体检的健康人263例，汉族142例，回族121例，其中男性137人，女性126人，年龄在18岁－65岁，1，2，3级亲属中均无白癜风患者。患者之间、对照组之间及患者与对照组之间均无血缘关系，对照组性别、年龄与患者组差异无统计学意义。所有的研究对象签署知情同意书，并完成流行病学调查表，静脉采血3－5ml，EDTA抗凝，－20℃保存。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取 取外周EDTA抗凝血200μl，采用Tangen公司DNA提取试剂盒提取基因组DNA，用紫外分光光度法 （A260／280比值）确定DNA纯度，A260测定DNA浓度。

1.2.2 引物的设计与合成 参照文献［5］设计引物，FokI： 5′ AGCTGRCCCTGGCACTGACTCTGGCTCT3′， 5′ GAGGGAGAAGAAGCAAGGTGTTTCCAT3′。 BsmI： 5′ GGGAGACGTAGCAAAAGG3′，5′CAGTGACCCTTGACCTCT3′。

1.2.3 PCR－RFLP检测两个SNPs的基因型

1.2.3.1 PCR反应体系 ddH2O 5.15μl，2×PCR Mix6.25μl，Primer F（10μmol／L）0.25μl，Primer R （10μmol／L）0.25μl，Taq DNA polymerase（5 U／μl）0.1μl，DNA template（50ng／μl）0.5μl，总体积12.5μl。

1.2.3.2 PCR反应条件设置 预变性95℃5min，变性95℃30s，退火60℃30s（FokI）、52℃30s（BsmI），延伸72℃30s，总延伸72℃10min，35个循环。PCR完成后，用2.5%琼脂糖电泳检测反应产物。

1.2.3.3 限制性核酸内切酶的选择及酶切反应条件：分别为FokI和BsmI限制性内切酶下37℃孵育16小时。

1.2.3.4 FokI酶切反应体系：FokI酶0.25μl，10×NEBbuffer 1μl，ddH2O3.75μl，DNA 模板5μl，总体积10μl；BsmI酶切反应体系：BsmI酶0.25 μl，10×NEBbuffer 1μl，ddH2O 3.65μl，100×BSA0.1μl，DNA模板5μl，总体积10μl。酶切孵育完成后进行3%琼脂糖凝胶电泳，并在Syngene凝胶成像仪下观察并记录结果，判断基因型。

1.2.4 质量控制

1.2.4.1 重复性试验 为保证酶切结果的正确性，随机抽取了30例样本进行了2个SNPs位点的PCRRFLP重复实验，结果与先前的分型结果均一致。

1.2.4.2 实验结果的双遍录入 用Excel建立数据库，对实验结果双遍录入和校对。内容包括样本编号、年龄、姓名和2个SNPs的基因分型结果，然后进行数据合并，经数据整理和校对无误后应用SPSS13.0软件进行分析。

1.3 数据处理

在SPSS13.0软件中将实验数据建立数据库。基因型频率等计数资料分析采用χ2检验，P＜0.05为有统计学意义，用OR值和95%CI确定SNPs多态性分型与白癜风的相关性。

Hardy－Weinberg平衡定律吻合度、各SNPs间连锁不平衡（LD）分析和单体型分析均采用SHEsis在线软件进行分析（http：／／analysis.bio－x.cn／my－Analysis.php）。

2 结果

2.1 遗传平衡性检验（Hardy－Weinberg检验）

应用SHEsis软件对患者组和对照组FokI、BsmI两个位点的基因型分布进行 Hardy－Weinberg平衡检验，均符合 H－W 平衡（P＞0.05），说明所选对照组具有群体代表性。

2.2 VDR基因FokI、BsmI位点多态性酶切结果

图1为FokI（C→T）位点酶切电泳图谱，1泳道为FF野生纯合子，产生267bp一个片段，2、3、7、8、9泳道为Ff杂合子，产生267bp、206bp和61bp（由于61bp片段过小，在3%琼脂糖凝胶电泳中不易分辨，但不影响基因型分析）三个片段，5、6、10泳道为ff突变纯合子，产生206bp和61bp两个片段，M 为100bp－600bp DNA Marker。图2为BsmI（A→G）位点酶切电泳图谱，1、2、3、4、6、7、8、9、10泳道为bb纯合突变子，产生193bp和165bp两个片段，5泳道为Bb杂合子，产生358bp、193bp和165bp三个片段，11泳道为BB纯合子，产生358 bp一个片段，M为100bp－600bp DNA Marker。

图1 FokI位点酶切电泳图谱

图2 BsmI位点酶切电泳图谱

2.3 VDR基因FokI、BsmI位点基因型分布及与白癜风易感性的关系。

2.3.1 FokI位点的基因型和等位基因的分布频率在宁夏回汉族白癜风患者和对照组中均无统计学意义。

2.3.2 BsmI位点的基因型和等位基因在宁夏回汉族白癜风患者和对照组中的分布频率见表1－3。

2.4 VDR基因单体型与白癜风遗传易感性的关联分析

连锁不平衡（Linkage disequilibrium，LD）分析采用SHEsis软件分析VDR基因FokI和BsmI的连锁不平衡系数（coefficient of linkage disequilibrium，D’），结果显示各SNP位点两两之间均存在较强连锁不平衡，各位点间均D’＞0.6。

表1 宁夏回族白癜风患者组与对照组BsmI位点基因频率的分布

表2 宁夏汉族白癜风患者组与对照组BsmI位点基因频率的分布

表3 宁夏地区白癜风患者组与对照组Bsm I位点基因频率的分布

3 讨论

VDR基因位于12号染色体，且有高度多态性［6］，近年来对VDR的研究主要集中在第二外显子FokI、第八外显子BsmI、ApaI、第九外显子TagI以及在3’端下游区域的poly－A多态性［7］。到目前为止，已在多个种族和民族中发现VDR基因呈多态性分布，在不同种族和民族中分布有差异［8］。非洲人VDR FokI位点f等位基因的频率低于亚洲人和高加索人。亚洲人BsmI位点的B等位基因的频率低于高加索人和非洲人［9］。中国汉族人口中BsmI位点呈多态性分布，突变型BB基因型频率与韩国人的分布频率相似，而远低于白种人的分布频率［10］。

目前，国内外许多学者研究了不同地区及不同民族的白癜风患者与VDR基因多态性的相关性，而尚无宁夏地区回、汉族白癜风与VDR基因多态性相关的研究，本课题分析了VDR基因Fok I和Bsm I两个位点与宁夏地区回、汉族白癜风患者发病的相关性，结果表明：Fok I位点基因型及等位基因的频率在宁夏回、汉族病例组与对照组的分布均无统计学差异（P＞0.05），而试验结果表明宁夏回族白癜风患者携带BsmI位点的Bb基因型的频率低于宁夏回族正常人群，分布有统计学差异（P＜0.05），提示了携带Bsm I的Bb基因型的回族正常人群白癜风的发病率可能减少，另外宁夏白癜风患者携带BsmI位点的Bb基因型的频率也低于正常对照人群，分布有显著差异（P＜0.05），推测Bb基因型可能是宁夏地区尤其是回族人群中白癜风发病的保护因素，在宁夏汉族白癜风和对照组中BsmI位点的基因型及等位基因的频率分布均无统计学意义。B等位基因在宁夏白癜风患者组与对照组间分布差异具有显著性意义（P＜0.05），提示B等位基因可能也是白癜风发生的保护因子。杨励［11］等研究了中国西北地区白癜风患者及正常人群中VDR基因BsmI、FokI等位点基因型频率和等位基因频率的分布，结果显示FokI位点基因型的频率分布白癜风患者与正常对照组无显著性差异，这一点与我们的研究结果相同，但不同的是杨励的结果中bb基因型在白癜风患者中频率较高，白癜风患者与正常对照组有显著性差异，可能与白癜风的发生发展相关。孙越，韩菁［12，13］等研究表明华中地区 VDR BsmI位点Bb基因型在汉族寻常型白癜风患者中频率较高，携带Bb基因型可能会增加汉族人群患白癜风的易感性，而本课题的结果却是VDR BsmI位点Bb基因型是宁夏地区尤其是回族人群中白癜风发病的保护因素，这进一步证实了不同民族及不同地区中VDR多态性的差异。Uitterlinden［14］在他的VDR的基因和生物学多态性一文中提出不同的种族群体中，等位基因频率的差别很可能是进化进程和人群遗传学行为的结果。白癜风还是一种由多种易感基因的组合致病作用和未知的环境为诱因的复杂综合征［15］，所以，生活环境的差异、饮食习惯的迥异、体内维生素D水平的高低、日照时间的长短以及观察样本数大小等因素也是一些可能发生此种结果的合理解释。白癜风作为多基因遗传疾病，由多个表型效应很小的微效基因作用，其表现型是遗传基因和环境因素相互作用的结果，需要结合周围环境因素综合分析。因此，对于VDR基因多态性与白癜风的关系还需在其他不同地区、不同民族之间进行更大样本的研究，并以家系为基础的关联研究，以及与其他可能的易感基因进行连锁分析。随着研究的进一步加深，会为VDR的生化功能与白癜风之间的关系提供基本参考信息。

［1］Jun Sun.Vitamin D and mucosal immune function［J］.Curr Opin Gastroenterol，2010，26（6）：591.

［2］Arnson Y，Amital H，Shoenfeld Y.Vitamin D and autoimmunity：new aetiological and therapeutic considerations［J］.Ann Rheum Dis，2007，66（9）：1137.

［3］Parsad D，Pandhi R，Dogra S，et al.Clinical study of repigmentation patterns with different treatment modalities and their correlation with speed and stability of repigmentation in 352vitiliginous patches［J］.J Am Acad Dermatol，2004，50（1）：63.

［4］中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会色素病学组.白癜风临床分型及疗效标准（2003年修订稿）［J］.中华皮肤科杂志，2004，37（7）：440.

［5］Okita H，Ohtsuka T，Yamakage A，et al.Polymorphism of the vitam in D3receptor in patients with psoriasis［J］.Arch Dermatol Res，2002，294（4）：159.

［6］Pani MA，Knapp M，Donner H，et al.Vitamin D receptor allele combinations influence genetic susceptibility to type I diabetes in Germans［J］.Diabetes，2000，49：504.

［7］Ban Y，Taniyama M，Yanagawa T，et al.Vitamin D receptor initiation codon polymorphism influences genetic susceptibility to type 1diabetes mellitus in the Japanese population［J］.BMC Med Genet，2001，2：7.

［8］Zmuda JM，Cauley JA，Ferrell RE.Molecular epidemiology of vitamin D receptor gene variants［J］.Epidemiol Rev，2000，22（2）：203.

［9］Fleet JC，Harris SS，Wood RJ，et al.The BsmI vitamin D receptor restriction fragment length polymorphism（BB）predicts low bone density in premenopausal black and white women［J］.J Bone Miner Res，1995，10（6）：985.

［10］冷曙光，宋文佳，王雅文，等.538名中国汉族人口维生素D受体基因多态性分析［J］.中华预防医学杂志，2002，36（5）：314.

［11］杨 励，王 雷，孙林潮，等.维生素D受体基因多态性与白癜风的相关性研究［J］.中国美容医学，2007，16（3）：302.

［12］孙 越，韩 菁，吴瑞勤，等 .白癜风患者维生素D受体ApaI基因多态性及免疫异常的研究［J］.中国中西医结合皮肤性病学杂志，2011，3：148.

［13］孙 越，韩 菁，吴瑞勤，等 .白癜风患者维生素D受体BsmI基因多态性及免疫异常的研究［J］.上海交通大学学报（医学版），2008，4：0392.

［14］Uitterlinden AG，Fang Y，Van Meurs JB，et al.Genetics and Biology of Vitam in D Receptor Polymorphisms［J］.Gene，2004，338（2）：143.

［15］Spritz RA.Recent progress in the genetics of generalized vitiligo［J］.J Genet Genomics，2011，38（7）：271.