TGF－Smad信号通路在病毒性心肌炎中的作用及银杏叶提取物干预的研究

潘晓波，孙立双，王晶华，孙景辉，翟淑波＊

（1.南航吉林分公司医院，吉林 长春130031；2.吉林大学第一医院，吉林 长春130021）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是儿科常见的心血管疾病，是由病毒感染引起的心肌变性、坏死，间质炎症细胞浸润及纤维素渗出为主要病理改变的疾病。VMC发病机制至今尚未完全阐明，涉及病毒的直接损伤、免疫机制、细胞凋亡、心肌纤维化、生化机制等［1－3］，因此能在 VMC发病中发挥重要作用的蛋白，必将成为调控该病的关键，并有望成为临床治疗该病的靶点。TGF－β1及其下游蛋白Smad2／3在肝、肾纤维化中发挥着重要作用［4－6］，本研究将探讨TGF－Smad信号通路在病毒性心肌炎中的作用及银杏叶提取物干预的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

（1）实验动物 纯种近系4周龄雄性Balb／C小鼠160只，体重16－20g，饲养于清洁级环境中，由吉林大学实验动物中心提供。

（2）病毒 柯萨奇病毒 B3（Coxsackie Virus B3，CVB3）（Nancy株）由吉林大学再生医学院惠赠。

（3）主要试剂 TaqDNA聚合酶：Takapa公司；dNTP：Takapa公司；PCR引物：上海捷瑞生物工程公司；DNA Marker DL15000，包括片段15 000 bp、10 000bp、7 500bp、5 000bp、2 500bp、2 000 bp、1 000bp、750bp、500bp、250bp、100bp：Takapa公司；琼脂糖：Oxoid公司。RT－PCR试剂盒：TransGen Biotech公司。

1.2 实验方法

（1）VMC小鼠模型的制备及分组 将160只4周龄小鼠随机分为两组，即实验组和对照组，其中实验组为120只，对照组40只。实验组小鼠腹腔接种0.1ml 102TCID50病毒液，而对照组腹腔注射等量的不含病毒的Eagel’s液，实验组小鼠随机分为以下3组：病毒模型组（VMC，n＝40）：注射病毒后1小时后腹腔注射PBS 20μl。银杏叶组（VMC＋GL，n＝40）：注射病毒后1小时腹腔注射银杏叶提取物0.2ml。参麦阳性对照组（VMC＋SM，n＝40）：注射病毒后1小时腹腔注射参麦注射液0.2 ml。连续21天。

（2）小鼠心肌组织的取材 注射病毒后第5、10、15、21天随机取各组部分小鼠（实验组与对照组各取8只），取心脏，用生理盐水冲洗干净之后，用剪刀沿中轴线剪为两半，一半浸泡于10%福尔马林溶液固定后HE染色，另一半保存于液氮内。

（3）RT－PCR 检 测 小 鼠 心 肌 细 胞 内 TGF－β1、Smad3mRNA的表达 分别称取组织各约为100 mg，浸在Trizol试剂中，用0.1%DEPC水处理过的毛玻璃片进行研磨；移入1.5ml EP管中，添至1 ml Trizol试剂涡旋混匀，再冰上孵育5min；4℃条件下，12 000rpm／min离心5min，取上清液后移入1.5ml新离心管，加0.2ml氯仿，混匀，冰上孵育5 min；4℃条件下，12 000rpm／min离心10min，取上层液相移入1.5ml新离心管，加0.5ml异丙醇，震荡，冰上孵育5min；4℃条件下，12 000rpm／min离心5min弃去上清液；加入1ml 75%乙醇，4℃条件，7 500rpm／min离心5min弃去上清液，室温下使之干燥透明，加入DEPC处理水20μl溶解RNA，经紫外分光光度计检测A260／280吸光度比值。

（4）引物序列引物设计 Smad3、TGF－β1基因序列通过 GenBank获得，由primer5.0设计，由大连宝生物科技有限公司合成。

Smad3：上 游：5′－TCTACTGCCGCTTGTGG－′下 游：5′－TGTGGTTCATCTGGTGGTC－3′TGF－β1：上游：5′－CCAAGGAGACGGAATACAGG－3′下游：5′－GTGTTGGTTGTAGAGGGCAAG－3′。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 小鼠心肌病理积分测定

对照组小鼠无任何病理变化，而病毒组小鼠则在第5天开始即出现明显的病理变化，可见炎症反应，有炎性细胞浸润，心肌细胞出现坏死，局部出现少量纤维增生；第10天时炎症进一步发展，可见炎性病灶出现，坏死区域增大，纤维组织增生增多，并可见大量炎性细胞浸润；第15天时炎性细胞浸润逐渐吸收，心肌纤维排列紊乱，并可见较多的纤维增生；第21天时坏死细胞由纤维组织代替，炎症细胞明显减少，纤维组织大量增生；药物干预后病理积分明显下降，且银杏提取物组与参麦阳性对照组相比差异不显著。见表1。

表1 各组小鼠心肌组织病理积分（）

表1 各组小鼠心肌组织病理积分（）

注：＊＊表示与对照组比较，P＜0.01；△，△△表示与 VMC组比较，P＜0.05和P＜0.01

组别 n病理积分5天 10天 15天 21天对照组80 VMC 8 2.05±0.08＊＊ 2.34±0.09＊＊ 3.72±0.01＊＊ 3.65±0.04＊＊VMC＋SM 8 1.97±0.01△ 2.09±0.02△△ 3.13±0.07△△ 3.01±0.02△△VMC＋GL 8 1.99±0.09△ 2.16±0.01△△ 3.21±0.08△△ 3.09±0.06△△

2.2 RT－PCR检测结果 （1）RT－PCR检测小鼠心肌TGF－β1mRNA表达结果 见表2。各组小鼠TGF－β1在411bp处清晰可见，经过灰度分析后可以看出对照组小鼠在各时期TGF－β1mRNA表达量维持在较低水平，病毒组小鼠各时期TGF－β1mRNA表达量则随时间的延长而逐渐增加，与对照组相比差异显著，P＜0.01，银杏提取物作用后小鼠TGF－β1 mRNA表达量则较病毒组明显下降，与病毒组相比差异显著，P＜0.05，参麦阳性对照组小鼠 TGF－β1 mRNA表达量与病毒组相比明显下降，差异显著P＜0.05，且参麦阳性对照组与银杏提取物组小鼠相比差异不显著。

表2 各组小鼠心肌中TGF－β1mRNA相对表达量（）

表2 各组小鼠心肌中TGF－β1mRNA相对表达量（）

注：＊，＊＊表示与对照组比较，P＜0.05和P＜0.01；△，△△表示与 VMC组比较，P＜0.05和P＜0.01

n 5天 10天 15天 21天0.19±0.01 VMC 8 0.25±0.03＊ 0.29±0.01＊＊ 0.32±0.03＊＊ 0.38±0.01＊＊VMC＋SM 8 0.21±0.02△ 0.24±0.13△ 0.23±0.01△ 0.27±0.07△△VMC＋GL 8 0.21±0.07△ 0.23±0.01△ 0.25±0.05△ 0.26±0.01对照组8△

（2）RT－PCR检测小鼠心肌Smad3mRNA表达结果 见表3。在336bp处清晰可见各组小鼠Smad3条带，经过灰度分析后可以看出对照组小鼠在各时期Smad3mRNA表达量维持在较低水平，病毒组小鼠各时期Smad3mRNA表达量则随时间的延长而逐渐增加，与对照组相比差异显著，P＜0.01，银杏叶组、参麦组则出现明显下降，与病毒组相比，差异显著，P＜0.05，且参麦阳性组与银杏叶组小鼠相比差异不显著。

表3 各组小鼠心肌中Smad3mRNA相对表达量（）

表3 各组小鼠心肌中Smad3mRNA相对表达量（）

注：＊，＊＊表示与对照组比较，P＜0.05和P＜0.01；△，△△表示与 VMC组比较，P＜0.05和P＜0.01

n 5天 10天 15天 21天0.19±0.01 VMC 8 0.26±0.04＊ 0.29±0.08＊ 0.32±0.02＊＊ 0.37±0.09＊＊VMC＋SM 8 0.21±0.13△ 0.24±0.10△ 0.23±0.03△ 0.24±0.01△△VMC＋GL 8 0.22±0.07△ 0.23±0.02△ 0.21±0.08△ 0.23±0.07对照组8△△

2.3 相关性分析

病毒组小鼠心肌病理积分与免疫组化检测TGF－β1表达量进行相关性分析，相关系数为r＝0.554，P＜0.05，两者呈正相关性。病毒组小鼠心肌病理积分与免疫组化检测Smad3表达量进行相关性分析，相关系数为r＝0.515，P＜0.05，两者呈正相关性。病毒组小鼠心肌TGF－β1与Smad3表达量进行相关性分析，相关系数为r＝0.406，P＜0.05，两者呈正相关性。

3 讨论

转化生长因子（TGF）是许多具有共同生物学特性的信号分子组成的大家族，主要包括两个成分，即：α和β，两者在分子组成、受体结构和生物活性上具有很大差异，分属不同蛋白家族［7－8］。TGF－β家族至少有30种细胞因子组成，在机体的免疫调节、胚胎发育、创伤修复、细胞生长和分化、细胞外基质的合成和储存等众多生理活动中发挥着重要作用，其中以TGF－β1结构和功能的研究最为深入。研究表明［9］，低浓度 TGF－β1可以在炎症早期刺激、聚集炎症细胞，促进炎症的发展，同时TGF－β1是现已证实的促纤维化的最重要的生长因子之一，能刺激体外培养的心肌成纤维细胞胶原基因的转录导致胶原合成增加，是胶原代谢最密切的细胞因子。研究发现［10］，TGF－β1可以促进家兔心肌成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白等mRNA及蛋白的表达，在心肌纤维化的发生过程中具有重要作用。

本实验通过RT－PCR方法检测小鼠心肌TGF－β1表达量发现，对照组小鼠在各时期均维持较低水平，而病毒组小鼠TGF－β1表达量随时间的延长而表达量逐渐增高，在第21天时表达量最高，且各时期TGF－β1表达量均明显高于对照组小鼠，差异显著，P＜0.05，可见在病毒性心肌炎小鼠的发病中TGF－β1发挥了重要作用。通过RT－PCR方法检测对照组小鼠和病毒组小鼠心肌Smad3的表达量发现，Smad3的表达量与TGF－β1表达量呈相关性表达，在病毒组小鼠则随时间的延长而逐渐增高，通过分别将病毒组小鼠心肌病理积分与TGF－β1、Smad3表达量进行相关性分析发现，病理积分与这两个蛋白均呈正相关性，可见TGF－β1、Smad3表达量的升高促进了病毒组小鼠心肌病理积分的发展。

银杏叶提取物是银杏叶经过多步骤分离提取后得到的天然活性物质，主要为黄酮类、萜类内酯化合物、多糖 类 等。 研 究 证 实［11－12］，EGB 具 有 广 泛 的 药理作用，如拮抗血小板活化因子、清除自由基、抗炎及抗过敏等；研究发现［13］，EGB能够通过调控TGF－β1信号通路达到抗大鼠肺纤维化及肝纤维化的作用。本实验中将银杏提取物作用于病毒模型组小鼠后发现，小鼠心肌病理变化明显改善、各时期炎症细胞浸润减少，病理积分较病毒模型组明显减小，与病毒组相比差异显著，同参麦组无差异。银杏叶提取物作用小鼠后可降低TGF－β1、Smad3表达量，影响TGF－β1－Smad3信号通路的活性进而达到改善心肌炎的作用，银杏叶提取物的作用机制也得到了进一步的确定。

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