紫杉醇联合放疗对鼻咽癌CNE细胞株凋亡蛋白表达的影响

杨永净，刘士新，刁建东，曹 玲，柳群丽

（1.吉林省肿瘤医院 放疗一科，吉林 长春130012；2.吉林大学中日联谊医院 肿瘤血液科）

鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在头颈部恶性肿瘤中占首位。放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段，早期病人单纯放疗效果较好，但因其发生部位隐蔽，症状多样性，就诊病人70%为局部晚期病人，单纯放疗疗效较差，局部复发和远处转移为常见的失败原因。为提高局部晚期鼻咽癌的治疗效果，局部放疗和全身化疗相结合成为国内外研究的热点。我们的前期研究发现紫杉醇可使细胞周期阻滞于G2／M 期，并诱导细胞凋亡和促进肿瘤细胞再氧合，而处于G2／M期的肿瘤细胞对放疗敏感。本研究应用紫杉醇联合放疗对鼻咽癌CNE细胞株凋亡蛋白表达的影响，进一步探讨紫杉醇对鼻咽癌细胞放疗增敏作用的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株、药物和试剂

人鼻咽癌CNE细胞株购自中国科学院上海细胞库，紫杉醇为山西普德公司产品。噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司，RPMI－1640、胰蛋白酶购自GIBCO公司，胎牛血清购自天津TBD公司。

1.2 细胞及培养条件

人鼻咽癌细胞培养于含有10%胎牛血清的PRMI－640培养基中，37℃，5%CO2条件下常规培养。

1.3 细胞总蛋白的提取

将对数生长期的鼻咽癌CNE细胞随机分为四组：空白对照组（不进行任何处理，给予等体积PBS）；放疗组（细胞以6Gy剂量进行照射）；紫杉醇组（细胞加入亚细胞毒剂量紫杉醇）；放疗联合紫杉醇组（细胞加入亚细胞毒剂量紫杉醇后，以6Gy剂量进行照射），将分组后的细胞株培养24h后，冷PBS洗涤2次，加入预冷的蛋白裂解液100μl，置于4℃摇床，温和振荡15min，14 000rpm，4℃离心15 min，取上清为全蛋白提取物。

1.4 BCA法蛋白定量

根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50∶1）配制适量BCA工作液，充分混匀；以BSA作为标准品，配制不同浓度（2000、1000、750、500、250、125、62.5、31.25μg／μl）标准溶液，各取10μl置于EP管中；取不同转染组蛋白提取物各10μl，至于不同EP管中；各管加入200μl BCA工作液；各管充分混匀，37℃放置30min，然后在562nm下比色测定；以BSA蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；根据所测样品的吸光值，在标准曲线上查得相应的蛋白含量（μg）；按相同蛋白浓度，分装蛋白，－70℃保存。

1.5 SDS－PAGE

分别取上述分离总蛋白按4∶1比例加入5×SDS样品缓冲液，混匀后，煮沸3－5min；取出样品，冷却至室温后，离心（10 000rpm）30s，取上清每孔加样30μl；40V电泳至浓缩胶与分离胶交界处，调整电压到100V，恒压电泳至分离胶底部。

1.6 转膜

剪6块3mm滤纸和一块PVDF膜，大小与胶相同；将剪好的膜在100%甲醇中短暂浸泡后，再在电转印缓冲液中浸泡平衡10－15min；滤纸用电转液浸泡；待电泳结束后，取下凝胶，切去积层胶作标记，电转缓冲液漂洗胶并平衡20min。然后按以下顺序安装：阳极侧－海绵－3张滤纸－NC膜－凝胶－3张滤纸－海绵－阴极侧。放置每一层时，均要去除各层间的气泡，以免影响转移效果；用塑料支架夹紧上述各层，置于转移电泳仪内，以恒流200mA转移2h；转移结束后，取下PVDF膜，用铅笔在膜的上缘作好标记。将膜置于平皿中，加入TBST室温漂洗10 min。

1.7 免疫结合

封闭：将上述PVDF膜放于平皿中，加入20ml封闭液（5%脱脂奶粉），室温轻轻振荡1h；TBST室温漂洗2次，5－10min／次；用抗体稀释液稀（含5%脱脂奶粉的TBST）释一抗（鼠抗人caspase3抗体、鼠抗人NF－κB抗体）至1∶500；封闭结束后，PVDF膜放入一杂交袋中，按0.1ml抗体溶液／cm2膜加入抗体，去除气泡，封口，4℃过夜；一抗中取出，TBST漂洗，10min／次，3－5次；用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体至1∶5000，加入杂交袋中，室温振荡1－2h；TBST 漂洗，10min／次，3－5次。

1.8 曝光成像

配制ECL发光工作液；取出洗涤的PVDF膜，在滤纸上沥干洗液，然后将膜完全浸入并与发光工作液充分接触，室温孵育1min；沥干发光工作液，放入X光片暗盒内曝光；显影冲洗。

2 结果

放疗组、紫杉醇组和放疗联合紫杉醇组caspase3表达高于空白对照组，放疗联合紫杉醇组组升高明显。与此相对应，放疗组、紫杉醇组、放疗联合紫杉醇组NF－κB表达下降，其中放疗联合紫杉醇组降低显著，说明放疗对鼻咽癌细胞的杀伤作用是通过诱导细胞凋亡来实现的，而小剂量的紫杉醇增强了对细胞凋亡的诱导作用。见图1，2。

图1 鼻咽癌CNE细胞株caspase3蛋白免疫印迹分析

图2 鼻咽癌CNE细胞株NF－κB蛋白免疫印迹分析

3 讨论

局部晚期鼻咽癌治疗失败的主要原因是局部复发和远处转移，目前国内外多项研究报道诱导化疗与辅助化疗对降低局部晚期鼻咽癌远处转移和提高局部晚期鼻咽癌总生存率没有实质性的改善。同期放化疗不但增加局部疗效且可以减少或消灭远处转移，治疗局部晚期鼻咽癌的效果较好，能够提高局部晚期鼻咽癌的生存率已成共识［1，2］。

紫杉醇是一种新型的微管稳定剂，具有独特抗癌活性，能加快微管蛋白聚合，延缓微管解聚，形成稳定的非功能性的微管束，从而破坏有丝分裂和细胞增殖。研究表明其不但能杀灭肿瘤细胞，控制微小的亚临床转移灶，降低远处转移的发生率，同时可作为放射增敏剂提高肿瘤的放射敏感性，与放疗具有协同作用［3］。刘君等［4］用低浓度（4 ×102mmol／L）的紫杉醇作用于喉鳞状细胞癌细胞株Hep22 12 h或24h后再给予2Gy剂量（直线加速器）进行照射比单纯放疗或单用紫杉醇能更明显地抑制细胞的生长，而单独使用2Gy剂量的照射并不能显著抑制细胞的生长，初步说明了紫杉醇能起到放疗增敏的作用。

本研究前期结果表明紫杉醇联合放疗组肿瘤抑制率明显高于放疗组及紫杉醇组，流式细胞检测紫杉醇可将细胞周期阻滞于G2／M 期，显著阻滞了细胞的周期进展，从而增强了抑制肿瘤细胞生长的作用。除上述机制外，本研究结果表明紫杉醇联合放疗可影响凋亡蛋白Caspase－3、NF－κB的表达，从而促进鼻咽癌细胞凋亡。Caspase蛋白酶家族是细胞凋亡的中心环节，Caspase－3在细胞中以酶原方式存在，凋亡信号激活上游Caspase进而激活下游Caspase－3，在凋亡执行阶段由下游Caspase－3对特定的底物进行切割，激活核纤层蛋白、肌动蛋白等蛋白酶及核酸内切酶等，抑制DNA修复酶从而破坏细胞骨架蛋白和核蛋白，使染色体断裂成小片段，这些不可逆转的改变导致细胞死亡［5］。Caspase－3是细胞凋亡信号中最关键因子之一，在Caspase－3家族的级联反应中，最后均通过激活Caspase－3使细胞进入凋亡。NF－κB是一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列特异结合并调节κ轻链转录的核蛋白因子，NF－κB在多种肿瘤的发生发展中发挥了重要作用，NF－κB的活性不仅参与了淋巴瘤和骨髓瘤的发生，也存在于多种实体瘤中［6］。实验证明化疗药物引起NF－κB活化能抑制细胞死亡，是肿瘤临床治疗中耐药性产生的关键因素［7］。NF－κB活化可抑制细胞死亡，因此NF－κB被认为是抗凋亡因子，大量的研究结果表明抑制NF－κB活性可以诱导多种肿瘤细胞凋亡或使细胞恢复凋亡现象［8］。

本研究结果表明紫杉醇组、放疗组及紫杉醇联合放疗组鼻咽癌CNE细胞株Caspase－3表达均较对照组增加，NF－κB表达均较对照组下降，尤以紫杉醇联合放疗组为著，提示紫杉醇影响凋亡蛋白的表达可能是其放疗增敏作用的机制之一。

［1］Wee J，Tan EH，TaiBC，et al.Randomized trial of radiotherapy versus concurrent chemoradiotherapy followed by adjuvant chemotherapy in patients with American Joint Committee on Cancer／In ternational Union against cancer stageⅢandⅣnasopharyngeal cancer of the endemic variety［J］.J Clin Oncol，2005，23（27）：6730.

［2］Zhang L，Zhao C，Peng PJ，et al.PhaseⅢ study comparingstandard radiotherapy with or without weekly oxalip latin in treatment of locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma：Preliminary results［J］.J Clin Oncol，2005，23（33）：8461.

［3］Lee N，Xia P，Quivey J M，et al.Intensity modulated radiotherapy in the treatment of nasopharyngeal carcinoma［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2007，53：12.

［4］刘 君，王家东.紫杉醇联合直线加速器放射对喉癌细胞作用的研究［J］.临床耳鼻咽喉科杂志，2002，16（9）：481.

［5］Worf BB，Green DR.Suicidal Tendencies：Apoptotic Cell Death by Caspase －Family Proteinase［J］.J Biol Chem，1999，274（29）：20049.

［6］Radhakrishnan SK，Kamalakaran S.Pro－apoptotic role of NF－kappaB：implications for cancer therapy［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1766（1）：53.

［7］Wang CY，Mayo MW，Baldwin AS Jr.TNF－and cancer therapyinduced apoptosis：potentiation by inhibition of NF－kappaB［J］.Science，1996，274（5288）：784.

［8］Nakanishi C，Toi M.Nuclear factor－kappaB inhibitors as sensitizers to anticancer drugs［J］.Nat Rev Cancer，2005，5（4）：297.