大火草总黄酮超声提取工艺研究

杨 林，于爱红，邵文斌，林 鹏，钱娇玲

（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730050）

大火草总黄酮超声提取工艺研究

杨 林，于爱红*，邵文斌，林 鹏，钱娇玲

（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730050）

目的：采用超声波辅助技术提高大火草中黄酮提取率。方法：采用单因素和正交实验法，以大火草总黄酮提取率为指标，确定最佳提取工艺条件。结果：最佳提取工艺条件为：乙醇浓度60%、料液比1∶50、超声功率90W、超声时间80min、提取3次，在该工艺条件下，总黄酮提取率为1.474%。结论：该提取工艺简单可行，适用于大火草总黄酮的提取。

大火草，总黄酮，超声提取，紫外分光光度法

大火草（Anemone tomentosa（Maxim.）Pei）系毛茛科银莲花属多年生草本植物，在我国主要分布在西南、西北、华北及华中地区，生于山地草坡[1]。大火草根状茎入药：性温、味苦，具有化痰、散瘀、消食化积、截疟、解毒、杀虫等功效[1]。目前，只见少量有关大火草化学成分分离和形态、显微方面的研究报道[2]。关于大火草黄酮类成分的研究几乎为空白。本文采用单因素和正交实验方法，研究超声波法[3-4]提取大火草总黄酮的提取工艺，为大火草生物活性、活性部位、活性成分等的研究，以及大火草植物资源的开发利用等的进一步研究提供数据支持，为大火草产品的开发奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大火草根 采自甘肃省舟曲县茶岗林场，经兰州理工大学杨林老师鉴定为毛茛科银莲花属植物大火草（Anemone tomentosa）的根；芦丁对照品 95%，南京替斯艾么中药技术研究所；NaNO2汕头市西陇化工厂有限公司；Al（NO3）3汕头市西陇化工厂有限公司；NaOH 天津市凯通化学试剂有限公司；乙醇 天津市百世化工有限公司，以上试剂均为分析纯。

AB-105N电子天平 Mettler Toledo Group；Cary-50 probe紫外分光光度计 Varian Australia RTY LTD；KQ-250DE型数控超声波清洗器 100W，昆山市超声仪器有限公司；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；DZF-6020型真空干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 大火草总黄酮提取液的制备 准确称取粉碎后的大火草根状茎样品（1.000g），加入75%乙醇40mL，超声功率为100W，50℃水浴超声提取60min，取出，抽滤后冷却至室温，滤液置于250mL容量瓶中，用75%乙醇定容至刻度，摇匀，得供试品溶液。

1.2.2 大火草总黄酮的定性分析[5-6]

1.2.2.1 盐酸-镁粉反应 取1mL供试液于试管中，加镁粉适量，摇匀，加2～5滴浓盐酸，即产生剧烈反应。溶液呈红色或紫红色，表明可能含有黄酮类化合物。

1.2.2.2 三氯化铝反应 取供试液点于滤纸上，晾干，喷雾三氯化铝试剂，干燥后，斑点呈鲜黄色，在紫外灯下观察，斑点有明显的黄绿色荧光，表明可能含有黄酮类化合物。

1.2.2.3 氨熏反应 取供试液滴于滤纸上，置氨气中熏片刻，斑点呈亮黄色，在紫外灯下观察，斑点呈黄色荧光，表明可能含有黄酮类化合物。

1.2.2.4 碱液实验 取供试液点于滤纸片上（干后，重复点样，使其溶液集中），干后，喷1%碳酸钠溶液或在氨蒸气中熏几分钟，呈现亮黄、绿或橙黄色。将氨气熏过的滤纸露置空气中，颜色逐渐褪去而变为原有的颜色，用碳酸钠水溶液处理后置空气中不褪色，表明可能含有黄酮或其苷类。

1.2.3 样品溶液的含量测定

1.2.3.1 标准曲线的制备[7]准确称取芦丁对照品9.5mg，加75%乙醇溶解并定容至50mL容量瓶中，摇匀，即为0.190mg/mL的对照品溶液。分别吸取芦丁对照品溶液0、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5mL于10mL容量瓶中，再分别加入0.3mL 5%NaNO2摇匀，放置6min后加入0.3mL 10%Al（NO3）3，摇匀，6min后再加入4mL 4% NaOH溶液，混匀，加75%乙醇至刻度，放置15min，以第一瓶为空白，按分光光度法，在510nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线。

1.2.3.2 样品总黄酮含量测定方法 精密量取“1.2.1项”中所得总黄酮供试液1mL至10mL容量瓶中，按“1.2.3.1”项下操作，测定吸光度，用标准曲线方程结合下式计算提取率：

式中：W为样品质量（mg），X为样品中黄酮浓度（mg/mL），V为最初定容体积（mL）。

1.3 单因素实验

1.3.1 乙醇浓度对提取效果的影响 精确称取干燥大火草根粗粉（2.0000g）5份（n=3），分别用浓度为40%、50%、60%、70%、80%乙醇各80mL，在50℃，100W条件下水浴超声提取60min，过滤，冷却，按照“样品总黄酮含量测定方法”测定并换算总黄酮含量。

1.3.2 提取时间对提取效果的影响 精确称取干燥大火草根粗粉（2.0000g）5份（n=3），在乙醇浓度60%，料液比1∶40，温度50℃，功率100W条件下，水浴超声提取20、40、60、80、100min，过滤，冷却，按照“样品总黄酮含量测定方法”测定并换算总黄酮含量。

1.3.3 料液比对提取效果的影响 精确称取干燥大火草根粗粉（2.0000g）5份（n=3），在乙醇浓度60%，温度50℃，功率100W条件下，料液比（g/mL）设定为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，提取80min，过滤，冷却，按照“样品总黄酮含量测定方法”测定并换算总黄酮含量。

1.3.4 提取次数对提取效果的影响 精确称取干燥大火草根粗粉（2.0000g）4份（n=3），在乙醇浓度60%，料液比1∶50，温度50℃，功率100W条件下，提取次数设定为4个水平：1、2、3、4次，提取80min，过滤，冷却，按照“样品总黄酮含量测定方法”测定并换算总黄酮含量。

1.3.5 超声功率对提取效果的影响 精确称取干燥大火草根粗粉（2.0000g）4份（n=3），在乙醇浓度60%，料液比1∶50，超声温度为50℃的条件下，超声功率设定为5个水平：60、70、80、90、100W，提取80min，过滤，冷却，按照“样品总黄酮含量测定方法”测定并换算总黄酮含量。

1.4 正交实验[8]

通过单因素实验分别探讨了乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数以及超声功率对大火草总黄酮提取率的影响，并确定了各实验因素的最佳水平。考虑到各因素间可能的相互依赖和相互制约会对黄酮提取率造成一定的影响，为得到理想的超声环境下大火草黄酮提取工艺，通过正交实验确定各参数的最佳组合。经单因素实验，不同的超声功率对大火草黄酮的提取率没有较明显的影响，实验以L9（34）正交表设计，4因素分别为单因素实验中所研究的乙醇浓度、料液比、提取时间以及提取次数，水平设计以单因素实验的结果为基础，设计因素水平表。

2 结果与讨论

2.1 大火草总黄酮定性实验结果

“1.2.2”项下定性实验均呈阳性反应，表明大火草根状茎中含有黄酮类化合物。

2.2 大火草总黄酮含量测定结果

通过实验，按分光光度法（中国药典2005版一部附录VA），在510nm波长处分别测定吸收度。以芦丁的浓度x（mg/mL）对吸收度A进行回归，得回归方程为：A=8.548x－0.0045（R=0.9998）。

2.3 单因素实验结果[9-10]

2.3.1 乙醇浓度对提取率的影响 可用于提取黄酮类化合物的溶剂很多，主要为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、水或某些极性较大的混合溶剂等，从溶剂的安全性和成本等考虑，本实验选择用乙醇做提取剂。由于黄酮类化合物种类复杂，不同浓度的乙醇对黄酮类化合物的溶解性能不尽相同，因此不同浓度乙醇对总黄酮提取也有不同的影响。

实验数据表明，乙醇浓度从40%升至60%，总黄酮提取率随之增加，当乙醇浓度达到60%时，黄酮提取率达到顶峰，乙醇浓度超过60%后，提取率骤然下降。因此，确定最佳提取溶剂为60%的乙醇。如图1所示。

图1 乙醇浓度对提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction

2.3.2 提取时间对提取率的影响 实验数据表明，提取时间在20～80min范围内，总黄酮提取率呈上升趋势，当提取时间为80min时，达到最大值，80min以后，总黄酮提取率骤然下降。这是因为在一定时间范围内，超声波产生的机械效应、空化效应及热效应，使细胞破裂，促进黄酮类化合物的释放和溶出，有助于溶质的扩散，从而提高了提取率，直至溶液中黄酮浓度达到最大值。但随着超声时间的延长，超声产生的热效应会使温度升高，当温度达到一定限度时，会使黄酮的结构发生变化而被降解[11]，并且随着时间的延长，杂质的含量会增加，不利于纯化过程。因此，选择最佳提取时间为80min。如图2所示。

图2 提取时间对提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the extraction

2.3.3 料液比对提取率的影响 实验数据表明，料液比从1∶20到1∶50时，总黄酮提取率显著增加。料液比是1∶50时，提取率达到最大值。但是当料液比超过1∶50时，总黄酮提取率明显下降。这是由于料液较低时，溶液浓度较高，黄酮类化合物提取不完全，而料液比过高时，溶剂的回收时间过长，反而造成了其中黄酮类化合物的损失，因此考虑到提取成本等因素，选择1∶50为最佳料液比。

图3 料液比对提取率的影响Fig.3 Effect of solid/liquid on the extraction

2.3.4 提取次数对提取率的影响 实验数据表明，大火草根总黄酮提取率随提取次数的增加呈上升趋势，当提取次数高于3次时，大火草总黄酮基本提取完全，提取率趋于平稳，考虑到提取成本，选择提取次数为3次。如图4所示。

图4 提取次数对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction times on the extraction

2.3.5 超声功率对提取率的影响 实验数据表明，随着超声功率的增加，大火草总黄酮提取率先增后减，当超声功率为90W时，总黄酮提取率最高。这是因为随着超声功率的增加，有利于细胞破裂，促进黄酮类化合物向溶媒中溶解，提高了提取率，当超声功率为90W时，黄酮已基本提取完全，溶液体系的渗透压达到平衡，功率再增加，样品颗粒会不断缩小，则造成对黄酮类化合物的吸附[12]，并且超声功率过大可能会破坏黄酮的结构，也会造成总黄酮含量的下降。所以选择最佳超声功率是90W，但其对大火草总黄酮提取率影响不显著。如图5所示。

图5 超声功率对提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on the extraction

2.4 正交实验结果

以上讨论了各单因素的影响，在实际操作中各因素是相互影响的。为全面考察影响因素，设计了4因素3水平L9（34）正交实验（表1），实验结果见表2。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

表2 正交实验表Table 2 Results of orthogonal experiments

实验数据表明，在超声提取过程中，乙醇浓度、提取时间、料液比、提取次数，这四个因素对总黄酮提取率均有一定影响，影响的主次顺序为乙醇浓度>提取次数>料液比>提取时间。乙醇浓度的影响是最显著的，最优的提取方案为A2B2C2D3，即乙醇浓度为60%，提取时间为80min，料液比为1∶50，提取次数为3次。

2.5 最佳工艺验证

准确称取大火草根状茎粗粉三份，每份1.000g，按正交实验确定的最佳提取方案A2B2C2D3，即乙醇浓度为60%，提取时间为80min，料液比为1∶50，提取次数为3次，超声功率为90W，用“1.2.3.1”项下的方法测定大火草根总黄酮的提取率，所得的总黄酮提取率分别为1.471%、1.477%和1.473%（均值为1.474%），比正交实验结果中的较优组1.354%高，表明此正交实验得出的最佳提取工艺符合实际。

3 结论

通过单因素实验和正交实验，确定了超声波法提取大火草根总黄酮最佳工艺为：乙醇浓度60%，提取时间80min，料液比1∶50，提取次数3次，超声功率90W。但该工艺并非各单因素实验中所确定最佳水平的简单组合，说明不同因素间可能存在一定的相互作用。在以上提取工艺条件下测得的总黄酮提取率高达1.474%。该工艺简单可行，适合于大火草黄酮类化合物的提取。

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Study on ultrasonic extraction technology of total flavonoids from Anemone tomentosa

YANG Lin，YU Ai-hong*，SHAO Wen-bin，LIN Peng，QIAN Jiao-ling
（College of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China）

Objective：The experiment adopted ultrasonic-assisted technology to improve extraction rate of total flavonoids from Anemone tomentosa.Methods：On the base of the single factor test and orthogonal experiment，in order to obtain the optional technology conditions of extraction rate of flavonoids.Results：The optimal technology conditions were as follows：The concentration of ethanol was 60%，solid liquid ratio was 1∶50，power of ultrasonic instrument 90W，extraction for 80min，extracting times was 3.The extraction rate of flavonoids from Anemone tomentosa was 1.474%under the optimal extraction technology.Conclusion：The optimum process was reasonable and feasible.

Anemone tomentosa；total flavonoids；ultrasonic extraction；ultraviolet spectrophotometry

TS201.1

B

1002-0306（2012）07-0244-04

2011－07－04 *通讯联系人

杨林（1974-），男，博士，副教授，主要从事中药新药、化学新药的研究开发。

甘肃省自然科学研究基金计划（0916RJZA007）。