离子色谱法测定玄参中的单糖和低聚寡糖

熊建飞，周光明，何 强，许 丽，张 磊，吴利敏

（1.西南大学化学化工学院，发光与实时分析教育部重点实验室，重庆400715；2.重庆大学三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆400045）

离子色谱法测定玄参中的单糖和低聚寡糖

熊建飞1，周光明1，何 强2，*，许 丽1，张 磊1，吴利敏1

（1.西南大学化学化工学院，发光与实时分析教育部重点实验室，重庆400715；2.重庆大学三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆400045）

建立阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定玄参中的葡萄糖、蔗糖、果糖和水苏糖的方法。以METROSEP CARB 1（150mm×4.0mm）阴离子交换柱为分离柱，脉冲安培检测，30mmol/L NaOH溶液为淋洗液等度洗脱，超声水提法提取玄参中的糖。峰面积的相对标准偏差为0.56%～9.01%，线性范围1～50mg/L，检出限为0.0452～0.0921mg/L，相关系数R为0.9931～0.9998，加标回收率在96.52%～109.56%之间。该方法预处理简单，准确度高，适用于快速测定玄参中的单糖和低聚寡糖。

阴离子交换，脉冲安培，等度洗脱，超声水提，玄参，单糖，低聚寡糖

玄参为玄参科，玄参属植物的干燥根，具有凉血滋阴、泻火解毒的功效。玄参中含有多种成分，如有机酸类、黄酮类、环烯醚萜类、甾醇、挥发油、糖类等[1]。玄参中的糖类主要为单糖和低聚寡糖，胡礼勇等人[2]从玄参中分离得到一种四糖，并经核磁共振谱图分析鉴定为水苏糖。水苏糖是天然存在的一种四糖，具有多种生理功能：能够促进体内有益菌增殖，改善消化道内环境；调节免疫、降血糖、降血脂，促进肠道对钙、镁等微量元素的吸收[3]；在防癌、抗癌、抗衰老等方面也有重要作用。目前，关于中草药的化学成分研究大多集中在酮类、苷类、萜类、有机酸、甾醇、脂类等[4-7]，而糖类化合物的研究大多数是多糖类物质[8]，单糖和低聚寡糖的研究相对较少，因此测定玄参中单糖和低聚寡糖，尤其是水苏糖的含量，可为进一步开发利用玄参提供参考依据。测定糖的方法主要有毛细管电泳色谱法[9]、气相色谱法[10]、高效液相色谱法[11]等，它们大多有需要衍生化处理或灵敏度低等缺陷。离子色谱法测定糖，样品前处理简单，无需衍生，且灵敏度高。糖能够在碱性环境中解离成阴离子，能够用阴离子交换柱进行分离，在pH≥12的环境中糖能够在电极上发生氧化还原反应，可以用脉冲安培检测器检测。离子色谱法测定的糖一般是单糖和二糖，而四糖的测定则较为少见。四糖的保留能力较强，往往需要在淋洗液中添加NaAc来减弱它的保留能力，有时还需要梯度洗脱[12]，从而增加了实验的复杂程度；而等度洗脱法避免了这些复杂的步骤，简化了测定过程。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葡萄糖（分析纯）、蔗糖、果糖（生化试剂） 成都市科龙化工有限公司；水苏糖 分析纯，Sigma公司；NaOH 分析纯，重庆川东化工有限公司；玄参 购于本地中药房；超纯水。

（Metrohm）861 Advanced Compact IC、METROSEP CARB 1（150mm×4.0mm）阴离子交换柱、脉冲安培检测器、IC-Net 2.3色谱工作站 瑞士万通公司；电子天平 上海精天电子仪器有限公司；隔膜真空泵 天津市腾达过滤器件厂；超声波清洗器 上海必能信超声波有限公司；布氏漏斗，0.45μm微孔滤膜。

1.2 色谱条件

METROSEP CARB 1（150mm×4.0mm）阴离子交换柱，脉冲安培检测，淋洗液30mmol/L NaOH溶液，柱温32℃，流速1.0mL/min，再生液200mmol/L NaOH溶液，加标定性，外标法峰面积定量。

1.3 标准溶液和淋洗液的配制

1.3.1 标准溶液的配制 分别精密称取葡萄糖、蔗糖、果糖0.1000g，放入100mL容量瓶中，加入20mL去离子水，搅拌溶解置入100mL容量瓶中定容至刻度，配成1000mg/L作为储备液；称取水苏糖0.0050g，放入100mL容量瓶中，配成50mg/L作为储备液。

1.3.2 淋洗液的配制 准确称取8.0g NaOH固体于100mL容量瓶中溶解，转入1000mL容量瓶中定容，配成200mg/L的NaOH溶液作为再生液。同样的方法称取1.2g NaOH固体溶解后，转入1000mL容量瓶中定容，配制成30mg/L的NaOH溶液作为淋洗液。

1.4 样品前处理

中草药的化学成分较为复杂，常规方法难以达到理想的提取效果，近年来发展起来的超声波提取技术是一种较为理想的提取方法。超声波能够破坏细胞结构，使其在瞬间破裂，使有效成分得以释放，提高了提取效率[13]。糖类化合物具有较好的水溶性，可以用水作提取溶剂，因此本实验采用超声水提法提取玄参中的糖。

将玄参切碎，称取0.1g，放入100mL小烧杯中，加入20mL去离子水，室温超声10min，用布氏漏斗过滤，将滤液定容至100mL，0.45μm微膜滤纸过滤，取滤液10mL于100mL容量瓶中定容，进样。

2 结果与讨论

2.1 淋洗液浓度、柱温和流速的选择

实验分别考察了5、10、15、20、25、30、35、40、50mmol/L NaOH溶液对分离度的影响，结果表明当NaOH溶液的浓度低于20mmol/L时，峰的分离度较差，随着淋洗液浓度的增大，峰形逐渐变好，当浓度为30mmol/L时，各个峰分离度较好，大于30mmol/L时果糖与水苏糖分离度变差。因此本实验选择30mmol/L NaOH溶液为淋洗液。

分别设定柱温为20、25、30、32、40℃，实验结果表明，降低温度峰的分离度稍有改变，峰形较好，但柱压逐渐增大，随着温度的升高分离度变差，综合考虑选择柱温为32℃。

分别设定流速为0.5、0.8、1.0、1.2、1.6mL/min，实验结果表明，改变流速对分离度的影响很小，随着流速的增大保留时间缩短，但柱压升高，为了保护色谱柱和缩短分离时间，选择1.0mL/min为流速。

在以上优化好的条件下，测得10mg/L混合标准溶液的谱图，横坐标为保留时间（min），纵坐标为峰高（nA），如图1所示。

图1 4种糖的标准色谱图Fig.1 Standards chromatography of 4 kinds of monosaccharides

2.2 精密度的测定

将10mg/L的标准溶液连续5次进样，分别计算峰高、峰面积的相对标准偏差（RSD）。计算结果如表1所示，由表1可知保留时间和峰高的相对标准偏差较大，而峰面积的相对标准偏差较小，因此本实验采用加标定性法进行定性分析，采用外标法对峰面积定量。

表1 相对标准偏差RSD测定结果（%）Table 1 The results of relative standard deviation（%）

2.3 超声时间的选择

图2 提取率与超声时间的关系Fig.2 Effect of ultrasonoscope on extraction rate

表2 线性方程、线性范围和仪器检出限Table 2 Linear regression equations，linear ranges and detection limits

称取0.1g样品6份，按1.4中样品处理方法进行样品前处理，分别超声5、10、15、20、25、30min。超声时间对糖提取效率的影响如图2、图3所示，横坐标为超声提取时间（min），纵坐标为提取率（质量分数%）。由图2、图3可知，提取时间对葡萄糖、蔗糖、果糖提取率的影响较大，对水苏糖影响较小，随着超声时间的延长，水苏糖的提取率略有下降。实验发现，超声时间越长，溶液杂质越多，使得过滤时间延长，因此本实验选择超声时间为10min。

2.4 标准曲线的绘制和仪器检出限的计算

分别配制1、3、5、10、30、50mg/L葡萄糖、蔗糖、果糖和水苏糖的混合标准溶液。分别测定六个混合标准溶液，Y为峰面积，X为浓度，绘制标准曲线，根据S/N=3计算仪器检出限，结果如表2所示。

2.5 样品测定结果

取玄参样品5份，分别编号为1、2、3、4、5，按照1.4中样品处理方法对样品进行前处理，按1.2中色谱条件进行测定，样品色谱图如图4所示，横坐标为保留时间（min），纵坐标为峰高（nA）。测定结果如表3所示，由表3可知，不同部位的玄参根中糖的含量有少许差距。

表3 样品测定结果（质量分数%）Table 3 The results of the samples（mass fraction%）

图3 样品色谱图Fig.3 Standards chromatography of sample

2.6 加标回收率

同时称取两份样品0.1012g，其中一份加入标准物质，按照1.4样品处理方法对样品进行处理，测得加标回收率如表4所示。

表4 加标回收率Table 4 The results of recovery percentage

3 结论

实验测得玄参中水苏糖的平均含量为9.37%，含量较高，因此玄参可以作为提取水苏糖的一种原料。水苏糖可以从玄参中被分离纯化，进而制成一种中成药，以提高玄参的药用价值。果糖与水苏糖的分离度不是很好，可能是二者在所选用的阴离子交换柱上具有较强相互作用引起的。

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Determination of monosaccharides and oligosaccharides in figwort root by ion chromatography

XIONG Jian-fei1，ZHOU Guang-ming1，HE Qiang2，*，XU Li1，ZHANG Lei1，WU Li-min1
（1.Key Laboratory on Luminescence and Real-Time Analysis（Southwest University），Ministry of Education，School of Chemistry and Chemical Engineering，Southwest University，Chongqing 400715，China；2.Key Laboratory of Three Gorges Reservoir Region’s Eco-Environment，Ministry of Education，Chongqing University，Chongqing 400045，China）

An anion exchange chromatography-pulsed amperometric detection method has been proposed for determination of glucose，sucrose，fructose，stachyose in figwort root.The analytical column was METROSEP CARB 1（150mm×4.0mm）.The elution was performed using 30mmol/L sodium hydroxide isocratic elution and the column temperature was 32℃.A ultrasonoscope was used for extracting sugars.The RSD of area ranged from 0.56%to 9.01%，the linear range was 1～50mg/L，the detection limits was 0.0452～0.0921mg/L，the related coefficient（R）was 0.9931～0.9998，and the spike recoveries ranged from 96.52%to 109.56%.The method was simple and had a high sensitivity.So this method can be applied for the determination of monosaccharides and oligosaccharides in figwort root.

anion exchange chromatography；pulsed amperometric detection；isocratic elution；ultrasonoscope；figwort root；monosaccharides；oligosaccharides

TS207.3

A

1002-0306（2012）07-0340-04

2011－06－15 *通讯联系人

熊建飞（1984-），男，硕士研究生，研究方向：离子色谱。

国家科技部重大专项项目（2008ZX07315）。