锁阳中粗多酚和粗多糖抗氧化活性的比较△

段园园，马耀，陈贵林

(内蒙古大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021)

中药科技

锁阳中粗多酚和粗多糖抗氧化活性的比较△

段园园，马耀，陈贵林*

(内蒙古大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021)

目的比较锁阳粗多酚和粗多糖的抗氧化活性，为锁阳入药提供依据。方法100 g锁阳粉末提取粗多酚和粗多糖。采用超声波辅助乙醇法提取粗多酚，依次用石油醚、三氯甲烷、醋酸乙酯和正丁醇进行萃取。同时用水提醇沉法提取粗多糖。用DPPH·法和ABTS+法进行锁阳粗多酚和粗多糖的抗氧化活性检测。结果多酚粗提物中的总酚含量达到了922.9 mgGAE·g-1(没食子酸当量)，而多糖粗提物中的多糖含量为366.6 mg·g-1(葡萄糖当量)。DPPH·法检测锁阳粗多酚和粗多糖的IC50值分别为79.3 μg·mL-1和145.6 μg·mL-1。经ABTS+法检测，二者的TEAC值分别为2.12 mmol·g-1和0.69 mmol·g-1。结论锁阳粗多酚的抗氧化活性远高于锁阳粗多糖。

锁阳；多酚；多糖；DPPH·；ABTS+

自由基是一类具有不配对电子的活泼化学基团，人体内会不断产生自由基如超氧阴离子、过氧化氢、羟基离子等。但随着年龄的增长，人体清除这些自由基的能力在下降。目前认为,人类疾病如各种炎症、动脉粥样硬化、早老性痴呆、帕金森氏病、急性脑血管病、癌症、衰老等,均与自由基的氧化刺激密切相关[1]，而传统的合成抗氧化剂又会有很多不良反应。因此,开发天然无害的抗氧化剂迫在眉睫。

锁阳CynomoriumsongaricumRupr.是一种重要的荒漠寄生植物，药食兼用，为内蒙古道地药材。锁阳性甘、温，具有补肾阳，益精血，润肠通便的功能[2]。锁阳富含多酚类及多糖类物质，二者兼有清除体内自由基、抗脂质氧化、抗衰老、预防心血管疾病、防癌、防辐射等生物活性，所以锁阳又称为“不老药”[2-3]。

目前，对锁阳的有关报道中，以多糖类物质为主,如多糖提取工艺的研究[4]，多糖对染色体端粒长度的影响[5]等，而抗氧化活性检测方面较少。对于富含的多酚类物质，只有鞣质[6]在含量方面有所报道，其他锁阳多酚类物质报道的很少。本实验采用DPPH·法和ABTS+法对锁阳多酚和多糖进行抗氧化测定并比较，以求找出锁阳中的主要抗氧化成分，为把锁阳开发为新型天然抗氧化剂提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

选用的锁阳采自内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗独贵特拉镇，经内蒙古大学生命科学学院生物系陈贵林教授鉴定，肉质茎自然干燥、粉碎，过30目筛，干燥后备用。

1.2 仪器

KUDOS SK7210LHC超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司),UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津有限公司),AP-01真空泵(天津奥特赛恩斯仪器有限公司),BT2202S sartorious电子天平(北京赛多利斯仪器系列有限公司),Xllegra X-15R离心机(美国贝克曼库尔有限公司),RE-5298旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，数显恒温水浴锅(金坛市科析仪器有限公司)。

1.3 试剂

没食子酸、碳酸钠、无水乙醇，葡萄糖、苯酚，浓硫酸,国产分析纯试剂；福林酚试剂、DPPH·(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS+[2,2-联氮-双-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)]、及Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)和维生素E购自Sigma公司；抗坏血酸(天津光复精细化工研究所)。

2 方法

2.1 标准曲线的制作

2.1.1 多酚标准曲线的制作 采用福林酚法[7]，分别取不同浓度的标样没食子酸溶液(0～15 μg·mL-1)2 mL，加入福林试剂1.0 mL，充分振荡后静置3～4 min，分别加入10 %碳酸钠溶液1.0 mL，摇匀置于25 ℃恒温水浴中反应2 h，于765 nm下测定吸光度，没食子酸标准曲线以吸光值A和没食子酸含量M作回归方程，见图1。

图1 多酚标准曲线

2.1.2 多糖标准曲线的制作 采用苯酚硫酸法[8]，分别取不同浓度的标样葡萄糖溶液(0～15 μg·mL-1)2 mL，再各加入5 %苯酚试剂1.0 mL，摇匀，迅速精密加入浓硫酸5.0 mL摇匀，盖上试管塞静置25 min后以蒸馏水为空白对照，于490 nm下测定吸光度，葡萄糖标准曲线以吸光值A和葡萄糖含量C作回归方程，见图2。

图2 多糖标准曲线

2.2 粗多酚及粗多糖的提取

2.2.1 粗多酚的提取 采用超声波辅助乙醇法，取锁阳粉末100 g以1∶15的料液比与60 %乙醇溶液混合，室温下，在功率为350 W超声波的辅助下进行提取，提取时间8 min，抽滤。乙醇提取液用旋转蒸发仪将乙醇相旋蒸。剩余水相依次用石油醚、三氯甲烷、醋酸乙酯和正丁醇萃取，每种溶剂萃取3次，每次3 h，将醋酸乙酯相和正丁醇相真空旋转蒸发。然后用甲醇将两相旋蒸的剩余部分合并，置于通风厨中直至样品干燥，然后将所得固体研磨成粉末得到4.09 g，放于干燥阴凉处备用。

2.2.2 粗多糖的提取 采用水提醇沉法，取锁阳粉末100 g，加入95 %的乙醇按1∶12的料液比进行浸提，浸提12 h后，除去上清液，滤渣自然干燥。将干燥后的滤渣用蒸馏水以1∶12的料液比在97 ℃下回流提取3 h，分别收集上清液和滤渣备用。将收集到的滤渣按上述方法再次回流提取，合并两次提取液。将提取液减压浓缩至总体积约120 mL，然后加入95 %乙醇至乙醇浓度达80 %后进行醇沉，12 h后收集沉淀，沉淀即为粗提多糖，待沉淀自然干燥后将其研磨成粉末得到8.05 g，放于干燥阴凉处备用。

2.3 粗多酚和粗多糖的含量测定

同标准曲线的制作相同，多酚含量以mg没食子酸/g粗提多酚表示，为(922.9±25.2)mgGAE·g-1。多糖含量以mg葡萄糖/g粗提多糖表示为(366.6±15.9)mg·g-1。粗多酚含量为粗多糖的2.5倍。

2.4 抗氧化活性的测定

2.4.1 DPPH·法测定粗多酚和粗多糖 参照Golluecke A P B等[9]的方法，取2 mL不同浓度的样品液(每个浓度重复3次)进行测定。按照下列公式计算清除率：

清除率%=[A1-(A-B)]/A1×100 %

式中,A为2 mL DPPH·溶液+2 mL样品液的吸光度；B为2 mL样品液+2 mL乙醇的吸光度；A1为2 mL DPPH·溶液+2 mL乙醇的吸光度。

将锁阳粗多酚和粗多糖清除自由基的能力与维生素C、维生素E清除自由基的能力IC50值相比较，即清除一半自由基时所需的样品浓度，确定其相对抗氧化活性。

2.4.2 ABTS+法检测锁阳粗多酚及粗多糖抗氧化活性 参照Roberta Re等[10]的方法测定，取30 μL不同浓度的样品液(每个浓度重复3次)进行测定，将锁阳粗多酚和粗多糖清除自由基的能力与标准物质Trolox清除自由基的能力相比较，转化成TEAC值，即达到一定浓度测试物质相当的抗氧化能力所需要的Trolox的浓度，确定其相对抗氧化活性。Trolox标准曲线的线性回归方程为Y=4.553X+0.818，r=0.997。

3 结果

3.1 DPPH·法测定锁阳粗多酚及粗多糖抗氧化活性

DPPH·法测定锁阳粗多酚和粗多糖抗氧化活性是通过DPPH·的清除率来表示的，即IC50值越小，表明抗氧化活性越大。锁阳粗多酚IC50值为79.3 μg·mL-1，粗多糖IC50值为145.6 μg·mL-1。粗多酚的IC50为粗多糖的54 %，即粗多酚抗氧化活性为粗多糖的1.8倍，见图3。

图3 锁阳粗多酚和粗多糖IC50值的比较(n=3)

3.2 ABTS+法检测锁阳粗多酚及粗多糖抗氧化活性

TEAC值表示为达到一定质量浓度测试物质相当的抗氧化能力所需要Trolox的浓度，TEAC值越大，表明抗氧化活性越大。对于ABTS+自由基的清除能力，将各样品清除ABTS+的能力按Trolox标准曲线转化成TEAC值，锁阳粗多酚TEAC值为2.12 mmol·g-1，粗多糖TEAC值为0.69 mmol·g-1。粗多酚的TEAC值为粗多糖的3.1倍，见图4。

图4 锁阳粗多酚和粗多糖TEAC值的比较(n=3)

4 讨论

本实验中锁阳粗多酚含量为粗多糖含量的2.5倍。100 g锁阳粉末中没食子酸当量为葡萄糖当量的1.3倍。DPPH·法和ABTS+法测定锁阳粗多酚和粗多糖的抗氧化活性基本一致，DPPH·法检测粗多酚抗氧化能力为粗多糖的2倍，ABTS+法检测粗多酚抗氧化能力为粗多糖的3.1倍，结果表明锁阳粗多酚的抗氧化活性远高于粗多糖。因此，多酚可视为是锁阳的主要抗氧化成分之一。虽然锁阳粗多酚和粗多糖的抗氧化活性不如维生素C和维生素E,但锁阳中除了多酚和多糖外还有其他的抗氧化成分，如花青素类，三萜类等。锁阳作为整体入药，其所有的抗氧化成分的抗氧化活性相加后要优于单一成份的抗氧化剂维生素C和维生素E。一般认为水果中起抗氧化作用的成分主要是维生素C，但有研究通过对比了15种水果及33种蔬菜的抗氧化活性与维生素C含量的关系，表明其抗氧化活性与维生素C含量无明显的相关关系[11]。而且锁阳作为中药入药，其功能不止抗氧化一种，其他功能如补肾、助阳、益精、润肠等维生素C和维生素E却未必有。最近的研究表明，锁阳多糖可以通过抑制D-半乳糖衰老小鼠血细胞和脑细胞染色体末端端粒长度的缩短,从而延缓组织细胞的衰老进程[5]。锁阳粗多酚及粗多糖的抗氧化活性比一些中药类如黄连(249.856 μg·mL-1)[12]、地榆(260 μg·mL-1)[13]以及苦丁茶(265.3 μg·mL-1)[14]的抗氧化活性要强。因此，锁阳多酚和多糖作为新型天然抗氧化剂的原料，再加上锁阳抗衰老、抗癌、抗脂质氧化等功能，将为本身是药食兼用的锁阳提供更为广阔的应用前景。

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ComparationofAntioxidantActivityofCrudePolyphenolandPolysaccharideinCynomoriumsongaricum

DUAN Yuan-yuan，MA Yao，CHEN Gui-lin

(CollegeofLifeScience,InnerMongoliaUniversity,Hohhot010021,China)

Objective: Provide scientific basis forC.songaricumbeing a medicine by comparing antioxidant activity of polyphenol and polysaccharide ofCynomoriumsongaricum.MethodsWe extract crude polyphenols and polysaccharides from 100 gCynomoriumpowder and use ultrasonic-assisted method to extract crude polyphenols and then use petroleum ether,chloroform,ethyl acetate and n-butanol to extract pure polyphenols.At the same time,we extract crude polysaccharides with water extraction and alcohol precipitation method.Detect crude polyphenol and polysaccharide’antioxidant activity with DPPH· and ABTS+method.ResultsTotal phenolic content of crude polyphenol reach 922.9 mg·g-1(gallic acid equivalent),However,the total polysaccharide content of crude polysaccharide is 366.6 mg·g-1(glucose equivalent).Crude polyphenol and polysaccharide’ IC50values of DPPH· were 79.3 μg·mL-1and 145.6 μg·mL-1and TEAC values of ABTS+method were 2.12 mmol·g-1and 0.69 mmol·g-1.ConclusionThe result show that the antioxidant activity of crude polyphenol is far higher than crude polysaccharide.

Cynomoriumsongaricum;Polyphenols;Polysaccharides;DPPH;ABTS+

国家科技支撑计划项目(2011BAI07B07)，内蒙古科技创新引导奖励资金项目(2010年度)

*陈贵林，E-mail:guilinchen@yahoo.com.cn

2011-09-13)