耐红霉素的红霉素菌种选育

杨雪清

（西安利君制药有限责任公司，陕西西安 710077）

1 前言

在抗生素生产过程中，培养基成分改进和发酵条件改进只能充分发挥菌种的生产潜力，要想使菌种生产能力不断提高，最根本还是要依靠菌种本身固有的遗传特性。一般菌种经过多次传代或长期保存后，由于自发突变或异核体和多倍体的分离，使有些细胞的遗传形状发生改变，造成菌种不纯，生产能力下降。但微生物的自发突变频率很低，一般为10-6～10-8，正突变的频率更低，因而通过自然选育有可能提高生产能力或获得某种优良特性菌株，但效率低，进展慢，效果不显著。因此，常把自然选育和诱变育种交替使用[1]。抗生素产生菌对自身抗生素的抗性基因往往与该抗生素的生物合成基因连锁。不同活性的菌株，其对自身药物的耐受性不同。产生菌产量越低，对自身抗生素越敏感；产量越高，抗性程度越强，这是因为许多抗生素均能阻遏自己产生菌合成该抗生素，即所谓反馈调节作用。当抗生素合成达到一定水平时，反过来对生物合成途径中有关酶产生阻遏，或对酶活力产生抑制，使产生菌不能继续合成或仅合成低水平的抗生素。于是，可以利用抗生素这一作用来选育自身药物抗性菌株，即消除反馈调节突变性菌株，用以提高抗生素产量[1]。

本方法采用红霉素碱作为诱变剂筛选耐红霉素的红霉素生产菌株，取得较好的效果[2]。

2 材料与方法

2.1 仪器及设备

灭菌锅，超净工作台，接种针，培养皿，三角瓶，摇床

2.2 出发菌株

红色链霉菌LJ-12

2.3 培养基

2.3.1 斜面，平板，茄瓶培养基(g/L)

淀粉8，玉米浆12，氯化钠2.5，硫酸铵2.8，碳酸钙3，琼脂20，pH7.0～7.2。

2.3.2 摇瓶种子培养基(g/L)

淀粉38，黄豆饼粉10，蛋白胨5，白糊精15，葡萄糖8，氯化钠3，硫酸铵7.5，碳酸钙12，硫酸镁 0.28，磷酸二氢钾 0.15，豆油 2d/25ml。

2.3.3 摇瓶发酵培养基(g/L)

淀粉 35，黄豆饼粉38，硫酸铵2，碳酸钙7，葡萄糖55，磷酸二氢钾 0.5，豆油5d/25ml。

2.4 培养条件

2.4.1 斜面，平板，茄瓶培养条件

培养温度30℃，相对湿度40%～60%，培养时间7-8天。

2.4.2 摇瓶种子培养条件

培养温度30℃，相对湿度40%～60%，摇瓶装量25 ml/250 ml，三角瓶，摇床转速220 cpm，培养时间48 h。

2.4.3 摇瓶发酵培养条件

培养温度30℃，相对湿度40%～60%，摇瓶装量25 ml/250 ml，三角瓶，摇床转速220 cpm，培养时间6-7 d。

2.5 红霉素效价测定

效价测定采用抗生素微生物鉴定法，根据《中国药典2010年版》规定，红霉素标准品购自中国食品药品检定研究院，检定菌为短小芽孢杆菌[cmcc（B）63202]。

2.6 红霉素浓度梯度平板制备

向已灭菌的培养皿内倒入不含红霉素的平板分离培养基15 ml，将培养皿斜放，凝固后，使培养基成一斜面，然后倒入含有红霉素（1500 ug/ml）的培养基15 ml，平放，待凝固后即制得红霉素浓度梯度培养基。

2.7 处理过程

取单孢子悬浮液用10倍稀释法稀释至10-1、10-2、10-3。并分别涂布于红霉素浓度梯度平板培养基上，30℃倒置培养，待单菌落成熟，挑取单菌落一一对应接入小斜面经摇瓶发酵及效价测定得到其摇瓶生产能力。

3 结果与分析

3.1 分别用红霉素生产菌LJ-12单孢子悬浮液适当稀释后涂布于红霉素浓度梯度平板培养基筛选红霉素耐性变株，和不含红霉素的平板培养基上进行自然分离。以上两组平板上各挑选30个单菌落移种斜面，斜面培养成熟后，经摇瓶发酵后测定效价。结果见表1。

表1结果表明，红霉素耐性变株生产能力比自然分离菌株高，其中，红霉素耐性变株LJ-12-2摇瓶效价比出发株高10.8%。说明红霉素耐性突变株能解除或部分解除红霉素对红霉素生物合成的反馈抑制作用，从而提高其生产能力。

表1 红霉素耐性变株/自然分离株及出发株生产能力比较

3.2 突变菌株LJ-12-2遗传稳定性

采用自然传代的方法考察红霉素耐性突变株LJ-12-2的斜面传代稳定性，经过连续5次传代，分别进行摇瓶发酵并测定效价，结果见表2。

表2 传代试验

表2说明耐性突变菌株LJ-12-2自然传代五次，其生产能力差别不大，表明其遗传特性稳定。

3.3 LJ-12-2在65 m3大罐连续发酵结果

耐性变株LJ-12-2斜面培养成熟后，接种种子摇瓶培养48 h，接入小罐，中罐，大罐。大罐经186 h结束发酵，测定放罐效价，在发酵条件调控措施一致的情况下，连续5批发酵，结果见表3。

表3 LJ-12-2 在65m3大罐发酵结果

4 讨论

（1）抗生素产生菌在初级代谢期对其自身代谢产生的抗生素有不同程度的耐受性，耐受性越强，其在次级代谢期合成的抗生素越多，利用红霉素浓度梯度培养基有利于筛选红霉素高产菌株。

（2）经常性的有针对性的对红霉素生产菌种进行某些对其生长、生产有抑制作用的物质耐受性选育，对稳定和提高生产能力是必要的。

（3）经过以上试验的论述，可以得出用红霉素作为诱变剂对红霉素菌种进行处理，筛选出的红霉素耐受菌株用于生产，红霉素产量明显提高。故此方法是可行的，有效的。

[1] 吴剑波. 微生物制药[M]. 北京：化学工业出版社，2002，44-46.

[2] 熊宗贵. 发酵工艺原理[M]. 北京：中国医药科技出版社，2005，54.