羧甲基菊粉的制备及其抗氧化活性研究

杜秀园，任海伟，姚学平，王志凡

(1.西北民族大学医学院，甘肃兰州 730030;

2.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050;

3.甘肃白银熙瑞生物工程有限公司，甘肃白银 730913)

羧甲基菊粉的制备及其抗氧化活性研究

杜秀园1，任海伟2，*，姚学平3，王志凡1

(1.西北民族大学医学院，甘肃兰州 730030;

2.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050;

3.甘肃白银熙瑞生物工程有限公司，甘肃白银 730913)

采用氢氧化钠－氯乙酸反应体系，以异丙醇作为溶剂制备羧甲基菊粉(CMI)，并研究其抗氧化活性。以取代度为指标，通过单因素及正交实验优化CMI制备条件，并对其·OH清除活性和红外光谱进行研究。结果表明，CMI制备的最佳条件为碱化时间3min，氯乙酸用量6.75g，异丙醇用量4mL，醚化时间15min，该条件下取代度为1.3327。抗氧化活性研究表明，CMI具有一定的·OH清除能力，且与浓度呈正相关效应，但与取代度之间却无确定关系。红外光谱分析表明CMI的制备工艺可行，应用前景广阔。

羧甲基菊粉，取代度，抗氧化活性，红外光谱

菊芋(Helianthus tuberosu)俗称洋姜，为菊科向日葵属多年生宿根性草本植物，其块茎富含菊粉，含量达15%～20%。菊粉是由D－呋喃果糖以β－(2－1)糖苷键连接而成的多聚直链果糖，是自然界天然存在的可溶性膳食纤维，卫生部于2009年批准菊粉为新资源食品。菊粉具有多种药理活性，增殖肠道双歧杆菌，预防肠道感染;降低心血管疾病危害;促进矿物质吸收;防治便秘;防治骨质疏松等［1－2］。研究表明，对糖类物质进行适当的化学修饰可以提高其生物活性或拓展其生物利用度。目前，已有学者对菊粉的硫酸化、羧甲基化和氰乙基醚化进行了初步研究［3－6］，其中羧甲基化研究最为广泛。羧甲基菊粉(CMI)是将菊粉分子上的伯醇或仲醇基团被羧甲基取代，可广泛应用于多种领域，如用作阻垢剂及金属离子螯合剂，在制糖工业中用作CaCO3结晶沉淀的抑制剂［7］，在印染过程中用作洗除污染物的添加剂等。张利等［8］研究也发现CMI显著影响CaCO3晶体形态并可减缓CaCO3溶液中pH降低的趋势。因此，羧甲基菊粉具有很好的开发前景。目前针对羧甲基菊粉的研究多集中于制备方法和结构分析［9－10］，笔者也曾对菊粉羧甲基化工艺进行了初步研究，并制备得到羧甲基菊粉［11］，但对其制备条件的研究还不够全面，而且对产品抗氧化活性的研究尚少。因此，本文研究CMI制备的最佳工艺条件，并探讨其·OH清除能力，为菊粉新资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菊粉 白银熙瑞生物工程有限公司;1－(吡啶基偶氮)－2－萘酚(PAN) 天津市科密欧化学试剂开发中心;氯乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、氢氧化钠、异丙醇、甲醇、3，5－二硝基水杨酸等 均为分析纯;实验用水 超纯水。

真空干燥器 无锡市泰诺实验设备有限公司; PHSJ－3F酸度计 上海雷磁仪器厂;Cary50紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;HH－S数显恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂; SHB－ⅢA循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;KQ－250DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;TG16－WS高速台式离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;Nexus670 FT－IR傅立叶变换红外光谱仪 美国尼高力公司。

1.2 分析方法

1.2.1 取代度的测定 采用硫酸铜络合滴定法［12］。

1.2.3 红外光谱分析 对菊粉和CMI进行红外光谱结构分析。扫描范围4000～400cm－1，扫描次数32次，分辨率4cm－1。

1.3 CMI制备的实验方法

准确称取2.70g菊粉和0.40g NaOH，在研钵中研磨均匀，置入烧杯中，在40℃、功率90W条件下超声辅助进行碱化反应;然后加入一定量的氯乙酸和0.58g NaOH混匀，滴加一定量的异丙醇溶剂(体积分数为95%)后进行醚化反应(超声辅助条件同上)。反应结束后，所生成产物用甲醇洗涤至加入硝酸银溶液中无沉淀为止，真空干燥制得CMI。

研究碱化时间(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5m in)、氯乙酸用量(2.70、4.05、5.40、6.75、8.10g)、异丙醇用量(2、3、4、5、6m L)和醚化时间(10、15、20、25、30m in)四个因素对CM I取代度的影响。固定其它因素在3水平，研究其中某一因素对取代度的影响。然后在单因素基础上进行 L9(34)正交实验(见表1)，优化制备工艺。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal tests

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 碱化时间对取代度的影响 菊粉羧甲基化修饰过程中，碱化处理目的是为了产生活化中心，因此碱化时间的长短对取代度至关重要。由图1可知，随着碱化时间的延长，CMI取代度总体呈现先增后减的趋势，3.0m in时取代度达到最大值(1.31)。这是因为碱化反应阶段为可逆过程，反应时间并非越长越好，时间过长会导致菊粉发生降解，聚合度下降;而时间过短，则菊粉分子上的羟基转化为氧负离子数量减少，致使取代度较低。只有碱化时间适宜，NaOH充分渗透到菊粉分子中，活性中心才相应增加。因此碱化时间初步确定为3m in。

图1 碱化时间对取代度的影响Fig.1 Effect of alkalization time on substitution degree of CMI

2.1.2 氯乙酸用量对取代度的影响 根据反应原理，醚化反应的速率与卤代物浓度成正比。由图2可知，随着氯乙酸用量的增加，取代度逐渐增加，当氯乙酸用量为6.75g时，取代度最大，之后又逐渐减小。这是因为随着氯乙酸用量增加，所提供的CH2COO－基团增多，与菊粉反应机率增加，有利于羧甲基化。但由于反应条件处于碱性环境，氯乙酸容易消耗部分NaOH发生水解反应，导致整个反应体系pH降低，取代度下降。另外，氯乙酸用量的增加还会加剧副反应，从而影响羧甲基化［14］。因此，初步确定氯乙酸用量为6.75g。

图2 氯乙酸用量对取代度的影响Fig.2 Effect of chloroacetic acid amount on substitution degree of CMI

2.1.3 异丙醇用量对取代度的影响 由图3可知，当异丙醇量为5m L时，取代度最大。因为，随着异丙醇用量的增加，提高了菊粉的溶解性，从而增加了氯乙酸与菊粉分子活性中心的碰撞机会，有利于反应进行，表现为取代度逐渐增加。但若继续增加异丙醇用量，取代度反而下降。因此，初步确定异丙醇用量为5m L。

2.1.4 醚化时间对取代度的影响 由图4可知，随着醚化时间的延长，菊粉与醚化剂氯乙酸能够更加充分接触，反应物分子间碰撞机会增加，取代度逐渐增大。但反应时间过长(＞20min)，超声波通过分子振动频率直接影响反应体系的温度，使反应体系温度升高，促进氯乙酸水解副反应加快，或者加剧菊粉在碱性环境中的降解，增加物料黏附，取代度反而下降。因此，初步确定醚化时间为20min。

图3 异丙醇用量对取代度的影响Fig.3 Effect of isopropanol amount on substitution degree of CMI

图4 醚化时间对取代度的影响Fig.4 Effect of etherification time on substitution degree of CMI

2.2 正交实验优化设计

在单因素结果基础上，以取代度为指标，选取碱化时间、氯乙酸用量、异丙醇用量和醚化时间四个因素进行L9(34)正交实验，实验结果和极差分析见表2。

表2 正交实验设计与结果Table 2 Results and design test of the orthogonal tests

从表2极差分析可知，各因素对取代度的影响顺序依次为:碱化时间＞氯乙酸用量＞醚化时间＞异丙醇添加量，最佳组合条件为A2B2C1D1，即碱化时间3m in，氯乙酸用量6.75g，异丙醇用量为4m L，醚化时间15min。由于优化组合A2B2C1D1在上述9组实验中没有，故对其进行验证实验。经验证实验表明，A2B2C1D1组合的取代度为1.3327，均优于其他组合。该最优工艺条件下制备的CMI产物白细，且色泽均匀，感官状态良好。

2.3 清除·OH活性的研究

羟自由基(·OH)是已知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，它可以与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，使细胞坏死或突变。·OH清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标［14］。

由图5可以看出，在所选浓度范围内，CMI对·OH具有较好的清除作用，而且与质量浓度呈明显的二次方量效关系。用Excel对实验数据进行回归分析，回归决定系数R2为0.99以上，回归方程显著。通过回归方程，可得 CM I的半清除浓度 IC50为0.71g/L。

图5 CMI对·OH清除能力与质量浓度之间的关系Fig.5 Relationship between mass concentration and hydroxyl free radicals scavenging rate of CMI

CMI对·OH的清除能力，除了与质量浓度有关系外，还与取代度大小有关。图6为不同取代度下、质量浓度为4g/L的CMI溶液对·OH清除率的变化趋势。由图6可知，随着取代度的增大，CMI对·OH清除率总体呈增强趋势，但取代度为0.6～0.8范围对应的清除率却呈下降状态，这说明影响·OH清除率的因素比较复杂，取代度和清除率之间没有十分确定的对应增长规律。

图6 CMI对·OH清除能力与取代度之间的关系Fig.6 Relationship between substitution degree and hydroxyl free radicals scavenging rate of CMI

2.4 红外光谱分析

菊粉和CMI的红外光谱如图7和图8所示。由图可知，菊粉分子中O－H伸缩振动在3421.28cm－1处有一强吸收峰，而菊粉经羧甲基化后部分羟基被取代。CMI在1300～1650cm－1范围出现羧酸盐的特征吸收 峰:1606.25cm－1代表 COO－伸 缩 振 动，1404.94cm－1有与羰基相连的亚甲基的变形振动峰［15］。另外，1034.94cm－1处为醚键的 C－O伸缩振动，934.90cm－1是果糖基呋哺环的对称伸缩振动所造成的，770.63cm－1是呋哺环次甲基的横向振动造成的，说明羧甲基被引入到了菊粉分子中，制备工艺是可行的。

图7 菊粉红外光谱图Fig.7 IR spectrum of inulin

图8 羧甲基菊粉红外光谱图Fig.8 IR spectrum of carboxymethylinulin

3 结论

以菊粉为原料，取代度为指标，确定的羧甲基菊粉最佳制备条件为:碱化时间3m in，氯乙酸用量为6.75g，异丙醇用量4m L，醚化时间15m in，该条件下取代度为1.3327。抗氧化活性研究表明，CMI对·OH具有较好的清除作用，并随着质量浓度的增加清除作用逐渐增强，CMI的半清除浓度IC50为0.71g/L。然而，·OH清除率与取代度之间并无十分确定的对应增长规律。通过红外光谱进行结构表征证实，利用羧甲基化修饰方法对菊粉分子进行改性是可行的。菊粉经羧甲基修饰后表现出较好的抗氧化活性，使其应用范围更加广泛，具有广阔的开发应用前景。

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Study on preparation and antioxidant activity of carboxymethyl inulin

DU Xiu－yuan1，REN Hai－wei2，*，YAO Xue－ping3，WANG Zhi－fan1
(1.College of Medicine，Northwestern University for Nationalities，Lanzhou 730030，China;
2.College of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China;
3.Baiyin Xirui Biological Engineering Co.，LTD，Baiyin 730913，China)

Carboxymethyl inulin(CMI)was p repared in the reac tion system of NaOH－chloroacetic acid w ith isop ropanolas the solvent.The antioxidative activity of CMIwas studied.The p reparation technology of CMIwas op tim ized by sing le factor and orthogonal experim ents w ith the evaluation index of substitution deg ree.The scaveng ing ac tivities against hyd roxyl free rad icals and infrared spectrum of CMIwere stud ied.The results showed that the suitab le cond itions were as follows:alkalization tim e 3m in，chloroacetic acid am ount 6.75g，isop ropanol amount4m L，etherification time 15m in.The maximum substitution deg ree of CMIwas 1.3327 under the op timum reaction condition.Meanwhile，CM Ihad strong scavenging capacities against hyd roxyl free rad icals w ith a dosedependent effec t.Struc ture confirm ation by infrared spectroscopy(IR)p roved that the p reparation method of CMI was feasib le.

carboxym ethyl inulin(CMI);substitution deg ree;antioxidation ac tivity;infrared spec troscopy(IR)

TS201.2

B

1002－0306(2012)19－0224－04

2012－04－16 *通讯联系人

杜秀园(1990－)，女，本科，研究方向:护理营养学。