银鲳酶解物抗氧化活性研究

张敬敏，吕玲玲

（淮海工学院海洋学院，江苏连云港 222005）

银鲳酶解物抗氧化活性研究

张敬敏，吕玲玲

（淮海工学院海洋学院，江苏连云港 222005）

选用胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶对银鲳蛋白进行酶解以制备蛋白酶解物，以羟基自由基清除活性为指标确定银鲳最佳水解酶。结果显示，碱性蛋白酶的水解物抗氧化活性最强。实验对碱性蛋白酶水解银鲳的酶解条件（时间、温度、pH、酶添加量和固液比）进行正交实验设计，并对最佳水解条件下所获得的酶解物进行抗氧化活性测试。结果表明，银鲳蛋白碱性蛋白酶水解物对DPPH自由基和羟基自由基具有清除作用，其自由基清除效果呈现剂量依赖性，而且银鲳蛋白水解物还具有明显还原能力。所有这些体外抗氧化数据说明，银鲳蛋白水解物有明显的抗氧化效力。

抗氧化，银鲳，酶解，肽，酶解物

海洋生物长期处于海水这样一个特异的封闭环境里，在进化过程中产生了与陆地生物不同的代谢系统和机体防御系统，因此海洋生物中蕴藏着许多功能特异、结构特殊的生理活性物质。向海洋索取食物、功能蛋白和特殊活性物质，已成为世界各沿海国家海洋开发的一项重要内容，这其中海洋活性肽的开发研究备受科研工作者的关注。银鲳属于鲈形目，鲳科，主要分布在印度西太平洋区域、中国东部与西部和西南部朝鲜半岛。银鲳占鲳鱼总量的84%，并在中国、科威特、伊朗、日本等国家的渔业中起着重要的作用[1]。国际市场上，银鲳被公认为一种经济价值极高海洋可食鱼种。银鲳肉厚、刺少、味佳，营养丰富，每100g银鲳鱼肉含蛋白质15.6g、脂肪6.6g、碳水化合物0.2g、钙19mg、磷240mg、铁0.3mg。银鲳脂肪多为不饱和脂肪酸ω-3系列，其胆固醇含量也低于所有的动物性食品。实验对银鲳鱼肉蛋白酶解物的抗氧化活性进行研究，以期拓宽抗氧化活性肽的获取资源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

银鲳 购于当地超市，去皮，剔除骨，-18℃冻藏备用；胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶 无锡市雪梅酶制剂科技有限公司，生物级；DPPH（1，1-di1phenyl-2-picryl-hydrazyl） Sigma公司，色谱纯；其它试剂 均为分析纯。

YP-001N电子精密天平、pHS-25数显pH计 上海精密科学仪器有限公司；722S型分光光度计 上海楼光技术有限公司；HZS-H水浴振荡器 哈尔滨市东明医疗仪器制造厂；GL-21M高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；DS-1型高速组织捣碎机 上海标本模型厂。

1.2 实验方法

1.2.1 酶解工艺流程 银鲳→解冻→匀浆→加热、调pH→加酶→保温水解4h→灭酶（90℃，20min）→破乳化→离心（8000r/min，20min）→上清液

1.2.2 最佳水解酶的筛选 选用胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶在适宜酶解条件下对银鲳鱼肉进行酶解，并测定所得酶解液的氨基态氮含量和自由基清除活性。酶解条件如表1所示。

表1 各种蛋白酶酶解参数Table 1 The hydrolysis parameter of several protease

1.2.3 正交实验 根据最佳水解酶的筛选结果，确定碱性蛋白酶为银鲳蛋白最佳水解酶。以羟基自由基清除率为指标，选取时间、温度、加酶量和固液比四因素，采用L9（34）正交实验对银鲳酶解条件进行优化设计，因素水平见表2。

表2 因素水平表Table 2 Level values of each factor

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 水解度测定 甲醛滴定法。

1.2.4.2 DPPH自由基（DPPH·）清除活性的测定[2]DPPH自由基清除活性的测定按Bersuder法并稍加改动。将2mL DPPH自由基溶液（0.1mmol/L，溶于95%乙醇）置于试管中，加入一定量待测液，定容至4mL，振荡混匀。混合液室温放置30min后，在517nm处测吸光值Ai。对照为2mL DPPH自由基溶液加上2mL蒸馏水，并在517nm处测吸光值Ac。同体积待测液与2mL 95%的乙醇定容至4mL，并在517nm处测吸光值为Aj。DPPH自由基（DPPH·）清除活性用清除率SA（Scavenging activity）表示：

SA（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%

1.2.4.3 羟基自由基（·OH）清除活性的测定[3]取0.2mL FeSO4-EDTA混合液（10.0mmol/L）于5mL刻度试管中，并加入0.5mL的2-脱氧核糖溶液（10.0mmol/L），再加入0.6mL酶解物，用磷酸缓冲液（0.lmol/L，pH7.4）定容至1.8mL，空白及阳性对照管直接用磷酸缓冲液定容至1.8mL。再在样品及阳性对照管中加入0.2mLH2O2（0.1%），空白管加入蒸馏水0.2mL。溶液混匀后置于37℃恒温水浴中反应lh，然后加入质量分数为2.8%三氯乙酸（TCA）溶液1.0mL，4000r/min离心20min。取上清液2.0mL于另一支试管中，加入1.0%（w/w）硫代巴比妥酸（TBA）溶液1.0mL，混匀后置沸水浴中反应15min，冷却后稀释5倍，在波长532nm处测吸光度值。羟自由基清除活性用清除率SA表示，按下式计算：

SA（%）=[（Ac-As）/（Ac-A0）]×100%

式中：Ac为阳性对照管的吸光度；As为样品管的吸光度；A0为试剂空白的吸光度。

1.2.4.4 酶解液还原能力的测定[2]取一定浓度的样品（1～10mg/mL）0.1mL，加入2.5mL pH6.6的磷酸盐缓冲液（0.2mol/L）和2.5mL 1%的铁氰化钾溶液，混匀。将混合物在50℃保温30min后加入2.5mL 10%的三氯乙酸，混合后以3000r/min离心10min。然后，取上清液2.5mL，加2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1%的FeCl3，室温放置10min后，在700nm波长处比色，比色值越大，还原能力越强。

2 结果与分析

2.1 最佳水解酶的筛选

不同蛋白酶有着不同的特异酶切位点，因而蛋白酶的选择是生物活性肽制备过程中一个重要环节。同一种底物蛋白用不同的蛋白酶酶解时，所得到的酶解产物活性可能完全不同[4]。因此，有必要对银鲳蛋白的最适作用酶系进行筛选。本实验选取四种蛋白酶（即碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶）作为水解银鲳蛋白的酶源。

四种蛋白酶分别酶解银鲳蛋白的水解度结果如图1所示。由图1可知，碱性蛋白酶酶解产物的水解度最高（23.4%），而酶解效果最差的是胃蛋白酶，其酶解产物水解度为5.4%。

图1 不同蛋白酶水解物的水解度曲线Fig.1 Hydrolysis curves of Silver pomfret protein treated with various enzyme preparations

由图2可知，四种酶解物清除羟基自由基能力的顺序为：碱性蛋白酶>中性蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶。四种酶解产物清除羟基自由基的能力强弱与其水解度的高低顺序（见图1）基本一致。其原因据有关学者的研究认为[4-5]，水解度的大小指示蛋白分子在酶作用下所断裂肽键数的多少，水解度高意味着生成较多的小分子活性物质（小分子肽或氨基酸）；某种程度上可以说水解度与酶解产物抗氧化活性间有一定的相关性。

图2 不同蛋白酶水解物清除羟基自由基的活性Fig.2 Hydroxyl radical-scavenging activity of Silver pomfret protein hydrolysates with various enzyme preparations

2.2 正交实验

根据以上实验结果确定碱性蛋白酶为银鲳蛋白最佳水解酶。以羟基自由基清除率为指标，选取时间、温度、加酶量和固液比四因素，采用L9（34）正交实验对银鲳酶解条件进行优化设计。

表3 酶解最佳工艺条件的正交实验结果Table 3 Results of the orthogonal trial on optimal parameter of hydrolysis

由表3可知，时间、酶浓度、温度、固液比四因素对银鲳酶解产物清除羟基自由基影响效果各不相同，其中时间＞酶添加量＞温度＞固液比。同时可以得出碱性蛋白酶最佳酶解条件为：时间3h、温度45℃、酶添加量3000U/g原料、固液比1∶3。

2.3 银鲳酶解物抗氧化能力

按2.2节正交实验最佳酶解条件：时间3h、温度45℃、酶添加量3000U/g原料、固液比1∶3，对银鲳蛋白进行酶解，酶解液经离心后取上清液冷冻干燥成粉后，测酶解物抗氧化能力。

2.3.1 酶解物抑制DPPH自由基（DPPH·）的能力 碱性蛋白酶水解银鲳所获得的酶解物清除DPPH自由基（DPPH·）的活性见图3。由图3可知，在较低浓度下（≤8mg/mL），酶解物的清除效率与其浓度接近线性比例关系；当酶解物浓度超过8mg/mL，其清除效率增长极其缓慢。

图3 银鲳酶解物清除DPPH自由基的活性Fig.3 DPPH radical-scavenging activity of Silver pomfret protein hydrolysates

2.3.2 酶解物清除羟基自由基的能力 羟基自由基（·OH）是一种极强的氧化剂，它一旦产生，就立刻氧化与它紧邻的任何生物分子，例如核酸、蛋白质、糖以及细胞中的其他成分[6]。Fenton反应是常见的产生·OH的手段，它以过氧化氢为氧化剂，以亚铁盐为催化剂，链反应的中间过程产生极活泼、极具氧化能力的羟自由基：Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-。其中产生的·OH可通过氢抽提，单电子转移或加成等方式攻击、氧化其他物质。用Fenton反应产生·OH来攻击脱氧核糖、红细胞或其它成分可检测抗氧化剂清除·OH的能力[2，8]。如图4所示，银鲳酶解物具有很强的清除羟基自由基的能力，且在一定浓度范围内清除效率表现出明显的剂量相关性。当浓度达到5mg/mL，其清除效率高达91.5%。此时若继续加大浓度时，清除效率略呈下降趋势。这可能是因为酶解物的抗氧化能力已达到顶峰，多余的酶解物对抗氧化效果不但无济于事，

图4 银鲳酶解物清除羟基自由基的活性Fig.4 Hydroxyl radical-scavenging activity of Silver pomfret protein hydrolysates

反而由于反应液颜色的加深影响到吸光值的测定，

进而影响到抗氧化效率的测定结果。

图5 银鲳酶解物还原能力Fig.5 Reducing power activity of Silver pomfret protein hydrolysates

2.3.3 酶解物还原能力 一般情况下，还原能力与抗氧化能力呈正相关，实验参考Oyaizu的方法进行还原能力测定。酶解物将赤血盐[K3Fe（CN）6]还原成黄血盐[K4Fe（CN）6]，黄血盐再与Fe3+作用，生成普鲁士蓝，该物质在700nm处测定吸光值。实验通过检测普鲁士蓝的生成量，确定试样的还原力。吸光值愈高，表示试样还原力愈强。

图5显示，银鲳酶解物具有一定的还原力，银鲳鱼酶解物可做为电子供体与自由基进行反应并将它们转化为稳定物质，从而终止自由基链反应。

3 结论

本研究表明，鲳鱼肉酶解产物对自由基的清除效果不同，且还原能力也不同。其中对羟基自由基的清除能力相对较强，而对超氧阴离子的清除能力相对较弱。结果可能预示活性肽清除不同自由基的机制具有一定的差别，这与曹文红等人[7-8]的研究结果较为一致。下一步应对鲳鱼肉蛋白酶酶解产物进行分离纯化及各种抗氧化肽的鉴定。

[1]PENG Shiming，SHI Zhaohong，HOU Junli，et al.Genetic diversity of silver pomfret（Pampus argenteus） populations from the China Sea based on mitochondrial DNA control region sequences[J].Biochemical Systematics and Ecology，2009，25：1-7.

[2]李琳.鳙鱼蛋白控制酶解及酶解物抗氧化研究 [D].广州：华南理工大学，2006.

[3]REN Jiaoyan，ZHAO Mouming.Purification and identification of antioxidant peptides from grass carp muscle hydrolysates by consecutive chromatography and electrospray ionization-mass spectrometry[J].Food Chemistry，2008，108（2）：727-736.

[4]任娇艳.草鱼蛋白源抗疲劳生物活性肽的制备分离及鉴定技术研究[D].华南理工大学，2008.

[5]Li B，Chen F，Wang X，et al.Isolation and identification of antioxidative peptides from porcine collagen hydrolysate by consecutive chromatography and electrospray ionization-mass spectrometry[J].Food Chemistry，2007，102：1135-1143.

[6]郑荣梁，黄中洋.自由基生物学[M].北京：高等教育出版社，2007：18-19.

[7]曹文红，吴红棉，范秀萍，等.马氏珠母贝酶解产物清除自由基活性的研究[J].食品研究与开发，2009，30（1）：13-17.

[8]Eresha Mendis，Niranjan Rajapakse，et al.Investigation of jumbo squid（Dosidicus gigas） skin gelatin peptides for their in vitro antioxidant effects[J].Life Sciences，2005，77（17）：2166-2178.

Antioxidant activity of Silver pomfret protein hydrolysates

ZHANG Jing-min，LV Ling-ling

（Ocean Institute，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China）

Silver pomfret protein hydrolysates were prepared using commercial enzymes，namely pepsin，trypsin Alcalase，and neutral protease.The hydrolysates so prepared were effective as antioxidants in model systems，mainly by scavenging of hydroxyl free radicals.The hydrolysate prepared using Alcalase showed the highest antioxidant activity among all samples.Hydrolysis conditions（temperature，pH，enzyme to substrate level and solid/liquid ratio）for preparing protein hydrolysates with Alcalase from the Silver pomfret proteins were optimized by orthogonal design.the hydrolysates were assessed using methods of DPPH radical scavenging ability.In the best hydrolysis conditions，The antioxidant and free radical-scavenging activities of Silver pomfret protein hydrolysates prepared with alcalase were investigated by employing several in vitro assay systems，including the1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH），hydroxylradical-scavenging，andreducingpower.Silverpomfretprotein hydrolysates showed scavenging activity against free radicals such as DPPH·and hydroxyl radicals.The radical-scavenging effect was in a dose-dependent manner.Moreover，Silver pomfret protein hydrolysates also exhibited notable reducing power.The data obtained by the in vitro systems obviously established the antioxidant potency of Silver pomfret protein hydrolysates.

antioxidant；Silver pomfret；hydrolysate；peptide；enzymatic hydrolysis

TS254.1

A

1002-0306（2012）01-0112-04

2010－03－30

张敬敏（1972-），女，硕士研究生，讲师，研究方向：食品资源开发与利用。