超声波协同纤维素酶对黄精多糖和皂苷的提取研究

陶 涛，李立祥，张 芳，李 惠

（安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术教育部、农业部重点实验室，安徽合肥 230036)

超声波协同纤维素酶对黄精多糖和皂苷的提取研究

陶 涛，李立祥*，张 芳，李 惠

（安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术教育部、农业部重点实验室，安徽合肥 230036)

以九华山黄精为原料，水为提取溶剂，采用超声波协同纤维素酶方法对其多糖和皂苷进行综合提取。通过单因素和正交实验研究了纤维素酶与底物质量比、超声时间、超声温度、浸提pH、超声功率对多糖和皂苷提取率的影响。结果表明：影响最显著的是纤维素酶与底物质量比，其次是浸提pH以及超声功率，超声时间和超声温度的影响相对较小。优化得出最佳提取工艺是纤维素酶与底物质量比1%，超声时间40min，超声温度55℃，浸提pH5.0，超声功率300W。此时的多糖和皂苷提取率分别是39.36%和11.69%。相比传统提取方法，大大提高了多糖和皂苷的提取率。

黄精，超声波，纤维素酶，多糖，皂苷

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄精 九华山，安徽天品堂生态农业有限公司提供的地藏黄精，属多花黄精（Polygonatum cy-rtonema Hua），三年生；人参皂苷对照品Rb1 中国药品检验所；纤维素酶 张家港金源生物化工有限公司，50000u/g；试剂 均为分析纯；水 去离子水。

UV-2102C型紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；YBY-400中药粉碎机

嘉腾机电有限公司；HH-6型电热恒温水浴锅 江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；KQ-500DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；AB104-N型电子天平 Metter-Toledo Group；SENCOR系列旋转蒸发仪 上海申生科技有限公司；PB-10酸度计 Metter-Toledo Group；DL-5-B低速离心机 CNETRIFUGE。

1.2 实验方法

1.2.1 黄精的预处理 在对黄精成分测定的基础上，结合黄精多糖、皂苷含量以及经济价格的综合考虑，选取三年生黄精，烘干，粉碎，过40目筛，备用，测其干物质量91.68%。

1.2.2 黄精多糖和皂苷的粗提取方法 准确称取2.0000g黄精粉末，以水为提取溶剂按1∶15的比例加入提取试管中，用0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液将溶液调至一定pH。称取一定量的纤维素酶，加入10倍的0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液在40℃活化30min。将酶液加入提取试管中，在一定超声功率、温度等条件下提取一定时间，在95℃下灭酶20min。趁热过滤，将滤液用旋转蒸发仪（60℃）浓缩、冷却、定容至25mL，取2.5mL浓缩液定容至25mL，得皂苷待测液。取2mL浓缩液加入一定倍数体积的无水乙醇，搅拌均匀后置4℃冰箱中静置过夜，低速离心（4200r/min，10min），得多糖沉淀，热水溶解定容至500mL得多糖待测液。

1.2.3 多糖和皂苷测定方法 多糖测定方法[12]：蒽酮比色法。制得的标准曲线为：y=7.0688x+0.0251（x为多糖浓度，y为吸光度，R2=0.9958）。

多糖提取率（%）=（10-3C1×V1/m）×100%

式中：C1为由回归方程计算得出的多糖的浓度（mg/mL）；V1为多糖稀释后体积（mL）；m为黄精干物质的量（g）。

皂苷测定方法[13]：香草醛-冰醋酸-硫酸法。制得的标准曲线为：y=0.0046x-0.0444（x为皂苷浓度，y为吸光度，R2=0.9996）。

皂苷提取率（%）=（10-6C2×V2/m）×100%

式中：C2为由回归方程计算得出的皂苷的浓度（μg/mL）；V2为皂苷稀释后体积（mL）；m为黄精干物质的量（g）。

1.2.4 单因素实验 在保持其他因素不变的条件下，以黄精多糖和皂苷的提取率为指标，进行单因素实验，分别研究了纤维素酶与底物质量比、超声时间、超声波温度、浸提pH、超声功率对提取多糖和皂苷的影响。

在做单因素实验时，用4倍无水乙醇沉淀多糖，在单因素之后用同一条件（隔夜，4℃冰箱中）加入不同倍数的乙醇浓度，考察不同倍数乙醇对沉淀多糖含量的影响。

酶与底物质量比采用的水平为：0.1%、0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6%；超声时间采用的水平为：20、40、60、80、100min；超声温度采用的水平为：30、40、50、60、70℃；浸提pH采用的水平为：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；超声功率采用的水平为：100、200、300、400、500W；乙醇倍数的水平为：4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5倍。

1.2.5 正交实验 在单因素实验的基础上，将酶与底物质量比（A）、超声时间（B）、超声温度（C）、浸提pH（D）和超声功率（E）作为考察因素，每个因素选择4个水平（如表1），按L16（45）进行正交设计，以多糖和皂苷的提取率为指标，进行实验。

表1 正交实验因素水平Table 1 Factors of orthogonal design

1.2.6 统计分析 采用DPS7.55对正交结果进行统计分析，确定最佳提取工艺条件。

1.2.7 方法对比 待正交实验结束得出最佳提取条件后，选取相同黄精原材料，采用相同测定方法，用得出的最佳条件分别采用超声波不加酶法、加酶不超声水浴法和不超声不加酶法实验。并对实验结果进行比较。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 纤维素酶与底物质量比对提取率的影响 从图1可以看出，随着纤维素酶与底物质量比的增加，多糖的提取率增加比较明显，在质量比1%时多糖提取率达最大，在质量比1%之后，多糖提取率有稍微下降；皂苷的提取率在0.4%时达最大，再增加酶量皂苷提取率下降较明显，说明酶量的增加对皂苷提取率有抑制作用。因皂苷的提取率变化量不是很大，所以以纤维素酶与底物质量比1%作为适宜浓度。

图1 纤维素酶与底物质量比对提取率的影响Fig.1 Effect of quality ratio of cellulase enzyme to substrate on extraction rate

2.1.2 超声时间对提取率的影响 由图2可知，提取时间过短，可能提取不充分，但随着时间增加，多糖和皂苷都有一定的降解。皂苷和多糖的提取率随着超声时间的增加而增加，并分别在40min和60min时达到最大，而且在60min时，皂苷的提取率降低不是太多，所以综合考虑，选取60min作为适宜超声时间。

图2 超声时间对提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on extraction rate

2.1.3 超声温度对提取率的影响 由图3可以看出，在50℃时皂苷和多糖的提取率都达到最大，升高温度，提取率都有所降低。这是因为温度会影响纤维素酶的活性，温度低，酶活性不高，温度过高，酶活性失活，影响提取率。所以选择50℃作为适宜超声温度。

图3 超声温度对提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate

2.1.4 浸提pH对提取率的影响 图4可以看出，pH在3.0～5.0之间时，皂苷和多糖的提取率都呈上升趋势，并且在5.0时，皂苷和多糖的提取率同时达到最大，pH增加，提取率降低。说明适宜的pH有利于酶和底物的结合，增强纤维素酶的活性，提高提取率，所以选择5.0作为适宜pH。

图4 浸提pH对提取率的影响Fig.4 Effect of pH on extraction rate

2.1.5 超声功率对提取率的影响 由图5可以看出，皂苷和多糖的提取率随着超声功率的增大都有所提高，并分别在300W和400W时提取率达到最大，再增大超声功率，提取率下降。这是因为当超声波功率在一定强度范围内可促进酶介导的反应，但强度过大酶结构会发生不可逆变化[14]。同时功率过大，会使部分皂苷和多糖发生一定降解。所以最佳提取功率应为300～400W。

图5 超声功率对提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic intensity on extraction rate

2.2 不同乙醇倍数对沉淀多糖的影响

由图6可以看出，增加乙醇相对于黄精浓缩液的倍数，有利于沉淀更多的多糖，在加入7倍乙醇时沉淀基本达到最大，再增加乙醇倍数，多糖沉淀不再增加。所以选择7倍乙醇作为最佳沉淀多糖的乙醇倍数。

图6 乙醇倍数对沉淀多糖的影响Fig.6 Effect of multiple of ethanol on polysaccharide precipitation

2.3 正交实验

根据单因素实验结果得知各因素对提取结果的影响，确定正交实验水平。酶与底物质量比对多糖和皂苷最佳提取率影响不一致，在质量比1%时多糖提取率最佳，相对于多糖提取率变化，皂苷的提取率变化幅度不大，为获得最佳综合提取效果，以多糖的提取结果为主要指标，所以选择0.6%、0.8%、1.0%、1.2%四个水平。超声时间在40min至60min内，多糖和皂苷的提取率都处在较高的水平，所以选择30、40、50、60min四个水平。超声温度和浸提pH对多糖和皂苷提取影响趋势一致，分别选择45、50、55、60℃四个水平和pH4.5、5.0、5.5、6.0四个水平。超声功率在300W和400W时，皂苷和多糖的提取率分别达到最大，选择300、350、400、450W四个水平。表2为正交实验结果。

根据表2可知，多糖的最佳提取工艺为A4B2C3D2E1，即纤维素酶与底物质量比1.2%，超声时间40min，超声温度55℃，浸提pH5.0，超声功率300W。由极差R的大小，可以看出影响多糖提取率的因素依次为A>D>B>E>C，即纤维素酶与底物质量比>pH>超声时间>超声功率>超声温度。

表2 L16（45）正交实验设计及结果Table 2 The orthogonal table L16（45）and experimental results

表3 多糖提取率方差分析表Table 3 Polysaccharide yields in the variance analysis

通过进一步的方差分析（表3）可以看出：A因素和D因素对多糖提取率具有显著性影响，说明纤维素酶与底物质量比和浸提溶液的pH对多糖提取率起主要作用，B、C、E因素则没有显著性差异，即超声时间、超声温度和超声功率对多糖的提取率影响最小。

同样，由表2可知皂苷的最佳提取工艺为A1B2C3D2E1，即纤维素酶与底物质量比0.6%，超声时间40min，超声温度55℃，浸提pH5.0，超声功率300W。由极差R的大小可以得出影响皂苷提取率的因素依次为A>E>D>C>B，即纤维素酶与底物质量比>超声功率>pH>超声温度>超声时间。

表4 皂苷提取率方差分析表Table 4 Sibiricoside yields in the variance analysis

由表4方差分析可知：A因素、D因素以及E因素对皂苷提取率具有显著性影响，说明纤维素酶与底物质量比、浸提溶液的pH和超声功率对皂苷提取率起主要作用，B、C因素则没有显著性差异，即超声时间、超声温度对皂苷的提取率影响较小。

从以上各表分析中可以看出影响多糖和皂苷提取率的主要因素是纤维素酶与底物质量比、浸提液pH以及超声功率，超声时间和超声温度的影响相对小一些。因素A在对多糖和皂苷的影响因素中均列第一位，从综合提取的角度考虑，A3即纤维素酶与底物质量比1%时多糖和皂苷的提取率都较高，故A3为理想条件；因素B、C、D、E对多糖和皂苷的影响的最佳条件都相同，因此选取B2C3D2E1为最佳条件。所以最终的最佳提取条件为A3B2C3D2E1，即纤维素酶与底物质量比1%，超声时间40min，超声温度55℃，浸提pH5.0，超声功率300W。

2.4 验证实验

在此优化条件下进行3次平行验证实验，结果见表5。从表5中可知多糖平均提取率为39.36%；皂苷平均提取率为11.69%。

表5 验证实验结果Table 5 Verification results of extraction

2.5 方法对比

从表6可以看出，相比较传统水浴提取方法，超声波协同纤维素酶对多糖和皂苷的提取率有较大的提高，多糖提取率提高62.44%，皂苷提取率提高59.70%。同时对比单一的超声波和加酶法可以发现，超声波和纤维素酶的协同作用明显优于单一处理作用。

表6 不同方法对比Table 6 Comparison of different methods

3 结论

采用超声波协同纤维素酶方法，通过单因素和正交实验，得出提取黄精多糖和皂苷最佳综合条件为：纤维素酶与底物质量比1%，超声时间40min，超声温度55℃，浸提pH5.0，超声功率300W。相比传统水浴提取方法，超声波协同纤维素酶方法提取时间短，效率高，但在实际工业生产中，生产成本要相对高一些。

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Study on the extraction of polysaccharides and sibiricoside from polygonatum（polygonatumcy-rtonema hua）with cellulase enzyme under ultrasonic wave

TAO Tao，LI Li-xiang*，ZHANG Fang，LI Hui
（Key Lab of Tea Biochemistry&Biotechnology，Ministry of Education and Ministry of Agriculture，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

To use Jiuhuashan Polygonatum（Polygonatum cy-rtonema Hua）as raw material and water as solvent，synthetically of polysaccharides and sibiricoside was extracted from Polygonatum with cellulase enzyme under ultrasonic wave.The effect of the quality ratio of enzyme to substrate，ultrasonic time，ultrasonic temperature，pH，ultrasonic power on the extraction of polysaccharides and sibiricoside were investigated by single factor and orthogonal experiments.The results showed that the quality ratio of enzyme to substrate was the most significant factor affecting the synthetic extraction yield，the pH and ultrasonic power were the next place，and extraction temperature and extraction time effects were the least.The optimum extraction conditions were as follows：the quality ratio of enzyme to substrate 1%，ultrasonic time 40min，ultrasonic temperature 55℃，extraction pH5.0，ultrasonic power 300W.Under this condition，the yield of polysaccharides and sibiricoside were 39.36% and 11.69%respectively.The extraction rate of polysaccharides and sibiricoside had been greatly improved which compared to conventional extraction methods.

Polygonatum；ultrasonic wave；cellulase enzyme；polysaccharides；sibiricoside

TS201.1

B

1002-0306（2012）09-0271-05

黄精是多年生的百合科草本植物，又名鸡头参、老虎姜、野生姜等。黄精产地很广，唯产于九华山最佳，有“北有长白山人参，南有九华山黄精”之称。近年来，随着人们对黄精属植物的研究不断深入，已从该属植物中分离得到很多化学成分：糖类、甾体皂苷类、黄酮类等[1]，其中皂苷生物活性研究多集中在降血糖[2]、抗肿瘤[3-4]、抗HIV等方面。黄精多糖研究较

2011－08－22 *通讯联系人

陶涛（1985-），女，硕士研究生，主要从事茶学与天然产物研究。

国家林业公益性行业科研专项项目（201004055）。多，其药理活性广泛，具有增强免疫功能、抗肿瘤、抗辐射等多种生物学活性[5-6]。目前已有提取黄精多糖或皂苷的相关报道[7-10]，但综合提取两者及利用酶提取方法的文章未有报道。超声法在中药提取中具有简单、效率高、副产物少等特点，能达到比常规提取更理想的效果。中草药的细胞壁主要由纤维素构成，纤维素酶能特异性降解纤维素，破坏细胞壁，使细胞内物质最大限度地溶出。据相关研究，超声波和纤维素酶有协同作用，共同使用，能获得更大的提取率[11]。本文用九华山三年生黄精为原料，水为溶剂，采用超声波协同纤维素酶方法，确定最佳综合提取多糖和皂苷的工艺，为更好利用九华山黄精提供理论依据。