HPLC法测定松花粉中山柰酚的含量

王 正，顾 蓉，朱彩芳，郦红岩

(江苏吉贝尔药业有限公司，江苏镇江212009)

松花粉是松科植物马尾松(Pinus massoniana Lamb.)、油松(Pinus tabuliformis Carr.)或同属数种植物的干燥花粉，具有收敛止血，燥湿敛疮的功效，用于外伤出血、湿疹、黄水疮、皮肤糜烂、脓水淋漓［1］。目前国家卫生部已确认松花粉为新资源食品，并列为普通食品管理。

松花粉中含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、微量元素、糖类等物质，现代研究大多侧重于松花粉中氨基酸、微量元素的检测［2］，对其中的生物活性物质黄酮类成分的研究报道很少。唐雨［3］等研究发现松花粉中含有山柰酚等黄酮类化合物，但对其黄酮类化合物具体成分的定量研究报道很少，本文参考相关文献［4～6］，对其所含的山柰酚进行了含量测定，提供了对松花粉进行质量控制的方法和依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC－10A高效液相色谱仪，LC－10ATVP泵，SPD－10AVP可见紫外检测器;浙大智达N2000双通道色谱工作站;Satorius CP225D电子天平;HH恒温水浴锅(金坛中大仪器厂)。

1.2 试药 山柰酚对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110861－200808，供含量测定用)，甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。样品购自云南，经江苏大学欧阳臻教授鉴定为松花粉。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:甲醇 －0.4% 磷酸溶液(65∶35);流速:1.0 mL·min－1;柱温:30 ℃;检测波长:360 nm;进样 20 μL。理论板数按山柰酚峰计算应不低于2 500。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取山柰酚对照品适量，加80%甲醇制成每1 mL含25 μg的对照品溶液，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加80%甲醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.4 线性关系的考察 分别精密吸取一定量的山柰酚对照品储备液(浓度为 248.7 μg·mL－1)，加 80%甲醇制成浓度为 6.220、12.435、24.870、49.740、99.480 μg·mL－1的对照品溶液，分别精密吸取20 μL注入液相色谱仪，以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积积分值A为纵坐标(Y)，进行线性回归，计算得回归方程为 Y=16.663X －0.035 6，r=0.999 7，结果表明山柰酚在 0.124 4 ～1.989 6 μg 范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取2.2项下对照品溶液，依法测定，连续进样6次，测定峰面积，RSD为1.68%，表明其精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一样品供试液，分别在0、2、4、6、8 h测定山柰酚峰面积，其RSD为1.05%，表明样品在8 h内具有良好的稳定性。

2.7 重复性试验 分别精密称取同一批样品6份，依法处理，测定，结果样品中山柰酚的平均含量为2.767 mg·g－1，RSD 为1.23%。

图1 HPLC图

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品共9份(约0.25 g)，每3份一组，分别精密加入山柰酚对照品溶液(浓度为0.149 2 mg·mL－1)4、5、6 mL，按供试品溶液制备方法制备，得供试品溶液。依法测定，结果见表1。

2.9 样品含量测定 分别精密称取不同批次的松花粉样品，按供试品溶液制备方法制备，如法测定，结果见表2。

3 讨论

3.1 流动相的选择 选择甲醇－0.4%磷酸溶液体系，改变流动相的比例，通过试验摸索，甲醇－0.4%磷酸溶液比例在65∶35时，目标指标能够实现较好的分离，且其他成分对测定无干扰。

表1 加样回收率试验结果(n=9)

表2 样品含量测定结果

3.2 样品提取条件的选择 在研究过程中分别进行了不同浓度的甲醇提取、不同提取方法(加热回流、超声提取)和不同提取时间(0.5、1、1.5 h)的比较，最后确定以 80%甲醇回流1 h。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:191－192.

［2］王敏.松花粉的成分及药理作用研究进展［J］.安徽医药，2008，12(4):357 －359.

［3］唐雨，张瑜，袁久志，等.松花粉化学成分的分离与鉴定［J］.沈阳药科大学学报，2011，28(6):429 －432.

［4］陈勇，邹亲朋，刘向前，等.RP－HPLC测定糙叶五加不同药用部位中槲皮素和山柰酚［J］.现代药物与临床，2011，26(4):310 －312.

［5］于雷，严铭铭，杨智，等.HPLC同时测定蚊子草药材中槲皮苷，山柰酚含量［J］.中国中药杂志，2011，36(14):1985－1987.

［6］李忠，王晓丽.RP－HPLC法测定北柴胡地上部分山柰酚的含量［J］.中国野生植物资源，2006，25(6):61－62.