双模板大豆异黄酮类特异性分子印迹聚合物微球的制备及性能研究

李 超，石 波，张梦柯，韭泽悟，程永强，*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083;2.中国农业科学院饲料研究所，北京 100081; 3.日本国际农林水产业研究中心，筑波305－8686，日本)

双模板大豆异黄酮类特异性分子印迹聚合物微球的制备及性能研究

李 超1，石 波2，张梦柯1，韭泽悟3，程永强1，*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083;2.中国农业科学院饲料研究所，北京 100081; 3.日本国际农林水产业研究中心，筑波305－8686，日本)

为探寻大豆异黄酮类物质的富集分离的新方法和新思路，选用染料木苷和大豆苷含量总和为89.2%的大豆异黄酮为模板，采用沉淀聚合法，以4－乙烯基吡啶(4－VP)为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，成功制备了分子印迹聚合物微球，并对微球进行了吸附静态学、吸附动力学、类特异选择性和结构表征研究。通过紫外光谱法研究了模板分子与功能单体的相互作用，结果显示4－VP和模板分子作用强烈，模板分子和4－VP最佳摩尔质量比为1∶6。静态吸附实验表明印迹聚合物(MIP)与非印迹聚合物(NIP)相比，MIP对模板分子具有明显的特异性吸附。吸附动力学实验表明聚合物微球在5h内对模板分子达到饱和吸附。类特异选择性实验表明MIP对多种大豆异黄酮类单体组分具有明显的类特异性吸附，特异吸附量高。此印迹聚合物微球有望在大豆苷异黄酮富集、分离、检测方面得到广泛的研究和应用。

染料木苷，大豆苷，类特异性，聚合物微球

分子印迹技术(molecular imprinting technique，M IT)是指以某一特定的目标分子为模板，制备对该分子具有特异选择性聚合物的过程［1］。该技术制备的分子印迹聚合物具有高亲和性和选择性、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用范围广等特点，分子印迹技术在很多领域，如固相萃取、色谱分离、仿生传感、模拟酶催化等方面得到广泛的研究和开发，在食品工业、天然活性成分分离、环境监测等行业得到广泛的应用，分子印迹技术已成为近年来研究和应用的热点［1－4］。本实验选择较高纯度的大豆异黄酮(主要含有染料木苷和大豆苷两种单体，结构如图1所示)为模板分子，采用沉淀聚合法，合成了基于染料木苷和大豆苷为主的双模板大豆异黄酮类特异性分子印迹聚合物微球，并对其性能进行了研究，为今后大豆异黄酮类活性成分分离纯化、特异选择性吸附材料的制备提供了理论依据。

图1 黄酮母环、染料木苷和大豆苷结构式［5－7］Fig.1 Structure of flavonoid，genistin and daidzin

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆异黄酮 染料木苷含量为77.4%，大豆苷含量为11.8% 吉林省大豆研究中心提供;大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、黄豆苷、黄豆黄素、橙皮苷、芦丁 上海同田生物技术公司;乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、偶氮二异丁腈(AIBN)、4－乙烯基吡啶(4－VP)、丙烯酸(AA)、丙烯酰胺(AM)、甲基丙烯酸(MAA) Sigma公司;甲醇、乙酸 化学纯，国药集团;乙腈、甲醇 色谱纯，Fishmer scientific公司。

高压输液泵 2695、紫外检测器 2996 美国Waters公司;色谱柱GEA C18(4.6mm×250mm，5μm)北京金欧亚有限公司;高速台式离心机TGL－18C上海安亭公司;傅里叶变换红外光谱仪Varian660美国安捷伦公司;场发射环境扫描电子显微镜Quanta 200F FEI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 高效液相(HPLC)检测条件 流动相:乙腈(A相)、含0.1%(V/V)冰醋酸的水溶液(B相);梯度洗脱;流速:1m L/min;检测波长:260nm;柱温:40℃;进样量20μL;分析时间为62m in。检测程序如图2所示。

图2 大豆异黄酮HPLC梯度洗脱时间程序Fig.2 The diagram of gradient elution program

1.2.2 紫外光谱法分析模板与功能单体相互作用固定大豆异黄酮的浓度为558.6μg/m L(其中染料木苷浓度为0.001mmol/m L)，分别加入不同量的AA、4－VP、AM、MAA的功能单体溶液，振荡后放置12h，分别以相同浓度的各功能单体溶液做参比，检测大豆异黄酮紫外光谱的变化。

1.2.3 基于双模板(染料木苷和大豆苷)为主的大豆异黄酮分子印迹聚合物微球的制备 准确称取55.87mg(含有0.1mmol染料木苷)大豆异黄酮原料溶于80m L甲醇中，再加入68.4μL(约0.6mmol)4－VP，于振荡器中振荡4h，以使大豆异黄酮与4－VP充分相互作用。依次加入0.57m L(约3mmol)交联剂EGDMA和40mg引发剂AIBN，将溶液置入试剂瓶中超声脱气10min，然后向其中通氮气10m in，密封后，将其置入恒温水浴槽中，60℃下聚合反应24h。将产物以10000 r/min高速离心10min，取沉淀，用9∶1 (V/V)的甲醇/乙酸洗脱液索式抽提至HPLC检测洗脱液无模板分子为止，置于真空干燥箱干燥24h备用。NIP除聚合中未加入大豆异黄酮外，其余步骤相同［8－11］。

1.2.4 聚合物微球静态等温吸附线的测定 准确称量10份100mg MIP，分别加入不同浓度的大豆异黄酮溶液，30℃下振荡24h，使吸附达到平衡，以10000r/min的速度离心沉降10m in取上清液，高效液相检测吸附平衡后上清液中大豆苷和染料木苷的浓度，根据吸附量计算公式计算MIP对大豆苷和染料木苷的吸附量。以大豆异黄酮浓度为横坐标，M IP对大豆苷和染料木苷的吸附总量为纵坐标，做出等温吸附线。NIP等温吸附线的测定方法相同。

其中:Q为吸附量(μg/g);C1为吸附前溶液中的大豆苷或染料木苷的浓度(μg/m L);C2为吸附达到平衡后的上清液中大豆苷或染料木苷的浓度(μg/m L);V为吸附液的体积(m L);M为MIP或NIP的质量(mg)。

1.2.5 聚合微球吸附动力学实验 准确称量12份100mg MIP，加入相同浓度的大豆异黄酮溶液10m L，30℃下振荡吸附。分别在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12h取出离心，检测上清液中大豆苷和染料木苷浓度。根据吸附量计算公式计算M IP对大豆苷和染料木苷的吸附量。以大豆异黄酮浓度为横坐标，MIP对大豆苷和染料木苷的吸附总量为纵坐标，做出吸附动力学曲线。NIP吸附动力学曲线的测定方法相同。

1.2.6 聚合物微球的类特异选择性吸附实验 准确称量8份100mg印迹聚合物，分别加入适当浓度的染料木苷、大豆苷、黄豆苷、染料木素、大豆苷元、黄豆黄素、芦丁、橙皮苷标准溶液，采用静态吸附实验方法分别测定平衡饱和吸附量。评价聚合物的类特异选择吸附效果。

1.2.7 聚合物红外光谱和扫描电镜分析 利用Varian660傅里叶变换红外光谱仪，采用KBr压片法，分别对MIP和NIP进行红外光谱分析。利用Quanta 200F场发射环境扫描电子显微镜对M IP和NIP表面结构和粒径进行分析。

2 结果与讨论

2.1 功能单体种类的选择

MIP的制备过程中，模板分子和功能单体通过非共价键作用(如氢键)或者共价键的作用形成稳定的复合体是影响聚合物的高选择、高吸附性能的关键因素。从大豆异黄酮两种主要单体染料木苷和大豆苷的分子结构来看，染料木苷和大豆苷都具有相同的黄酮类母环结构，而且具有酚羟基，呈现弱酸性。从理论上讲，碱性功能单体更有利于和酸性模板形成稳定的主客体复合物［12－14］。

图3是使用4种功能单体(AA、4－VP、AM、MAA)，在模板分子与功能单体的不同的摩尔比例(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8)下相互作用之后的紫外光谱图。从(b)中可以看出，4－VP与模板分子的相互作用更加强烈，随着4－VP的浓度增大，大豆异黄酮的紫外最大吸收波长(260nm处)发生明显的红移，而其他三种则没有明显的变化。由此可推断，4－VP为理想的功能单体，4－VP本身表现为碱性，可以和模板发生酸碱作用，而且可以提供氢键受体和模板发生相互作用产生氢键，有利于印迹聚合物识别位点的产生。在1∶6时，红移最大波长达到400nm，继续增加功能单体，波长几乎不再发生移动，表明功能单体并非越多越好，只要功能单体和模板相互作用充分即可，过多的功能单体会导致聚合物非选择性位点、非特异性吸附增加。综合考虑，选择4－VP为功能单体，模板分子与功能单体物质的量比为1∶6来制备大豆异黄酮分子印迹聚合物微球。

图3 大豆异黄酮与不同功能单体相互作用紫外光谱图Fig.3 The interaction UV spectra of soy isoflavones with different functionalmonomers

2.2 静态等温吸附性能评价

图4是MIP和NIP在不同大豆异黄酮浓度下的静态等温吸附性能曲线，从图4中可以明显的看出，随着大豆异黄酮底物浓度的不断增加，最初MIP和NIP对大豆异黄酮溶液中的染料木苷和大豆苷的吸附总量增长迅速，但当浓度达到一定的量时，继续增加浓度，MIP和NIP对染料木苷和大豆苷的吸附总量趋于饱和。而且MIP对染料木苷和大豆苷的吸附总量明显大于NIP，特异吸附效果显著。这是由于M IP在合成中洗脱掉模板之后，形成了很多对染料木苷和大豆苷结构匹配的空间孔穴结构，因此对染料木苷和大豆苷具有较大的吸附量。而NIP在合成中未加入模板，形成的聚合物中功能团分布无序，没有形成对染料木苷和大豆苷分子空间结构匹配的识别位点，导致吸附总量远低于M IP。由此可知，合成的MIP对染料木苷和大豆苷具有较大的吸附量，且具有一定的特异选择识别性能。

图4 MIP和NIP的等温线Fig.4 The binding isotherm diagram of MIP and NIP to genistin and daidzin

2.3 聚合物的吸附动力学评价

图5是MIP和NIP在相同大豆异黄酮浓度下，对大豆苷和染料木苷吸附总量随时间变化的趋势。由图可看出，MIP和NIP对大豆苷和染料木苷的吸附总量在前5h内迅速增加，5h后，M IP和NIP对大豆苷和染料木苷的吸附达到平衡，吸附总量不再增加，吸附达到饱和。这是由于MIP在合成中将模板分子洗脱掉后，由功能单体和交联剂形成的空间立体孔穴分布深浅不一，吸附开始时，主要是聚合物微球外表面对模板分子的吸附，吸附速度较快。当外表面吸附达到饱和后，底物主要是通过外表面向聚合物微球内部扩散传质，传质阻力加大，导致吸附结合的速度下降，当吸附达到平衡后，吸附总量达到饱和。

表1 聚合物对不同底物的吸附量(μg/g)Table 1 The absorption of polymer to different substrates(μg/g)

图5 MIP和NIP对染料木苷和大豆苷的吸附动力学曲线Fig.5 The adsorption kinetic curve of MIP and NIP to genistin and daidzin

2.4 聚合物微球的类特异选择吸附性能评价

表1为MIP和NIP对不同底物的饱和吸附实验结果，由表可知，NIP对8种底物的饱和吸附量相差不大，这是由于NIP在合成中没有加入模板，即没有形成具有识别性能的孔穴。MIP对8种底物的吸附量明显大于NIP，这是因为MIP中含有很多固定功能基团的孔穴，而且这些功能基团具有与异黄酮类物质分子空间构型相键合的识别能力。因此MIP具有较高的特异识别性、选择性，NIP却不具备此能力。

聚合物微球对8种底物的饱和吸附量差值Q(MIP－NIP)差别显著，其中对染料木苷和黄豆黄苷的吸附量最大，这是由于MIP合成时所使用的大豆异黄酮模板中染料木苷占主要成分，染料木苷和黄豆黄苷无论是分子结构还是空间构型上的极为相似，使得MIP在吸附染料木苷和黄豆黄苷方面很难具备高度特异吸附性。在对大豆苷、染料木素、大豆苷元、黄豆黄素特异吸附方面，MIP也表现出较高的吸附量。这是由于大豆苷在M IP合成中充当第二模板分子，加之这四种单体都具备黄酮类典型母环结构，所以表现出较高的特异吸附能力。在对橙皮苷、芦丁特异吸附方面，MIP对这两种单体的特异吸附量相对较小，根据分子结构分析，可能是由于这两种单体分子结构中含有两个糖环，分子空间体积的增大加大了分子进入MIP印迹孔穴中的阻力，孔穴中的特异识别位点无法与这两种单体产生较好的键合作用所致［15］。印迹聚合物微球对两种模板分子的吸附量上，染料木苷的吸附量明显大于大豆苷，对染料木苷具有明显的选择性，而对大豆苷的选择吸附能力较差，很可能是由于染料木苷在模板中所占的比重较大，大豆苷较小，聚合物中形成的印迹孔穴大多数和染料木苷具有较好的匹配度，对染料木苷具有较好的选择吸附能力。总之，合成的印迹聚合物对类黄酮物质具有一定的类特异选择吸附性能。

2.5 结构表征与形态分析2.5.1 红外光谱分析 图6(a)、(b)、(c)分别为NIP、M IP和大豆异黄酮的红外光谱。比较(a)和(b)两图可知:(a)中1636.18cm－1和(b)中1636.00cm－1处峰为聚合物中交联剂EGDMA的C=C双键的伸缩振动峰，(a)中1597.97cm－1和(b)中1598.82cm－1处峰为功能单体4－VP的功能键吡啶氮C=N的峰［16－17］。C=C双键峰和C=N的峰很小，表明交联剂和功能单体4－VP大部分发生了交联聚合反应，只有很少一部分的残留［18］。4－VP的功能键吡啶氮C=N的峰波长发生了微弱的变化，很可能是由于M IP在合成过程中4－VP功能键吡啶氮C=N受到模板分子的作用以及模板去除后空间孔穴的形成引起的周围环境的改变等原因所致，这更加说明得到的印迹聚合物中含有与模板分子相互作用的功能基团，这为聚合物特异识别位点的形成创造了有利条件。

图6 NIP、MIP和大豆异黄酮红外光谱Fig.6 The infrared spectrogram of differentmaterials

整体观察MIP、NIP和大豆异黄酮图谱，NIP和M IP均有明显的羟基、羰基、酯基C－O－C等吸收峰，而且这些峰的峰形基本上一致，对照M IP和大豆异黄酮图谱，未在MIP中发现明显与大豆异黄酮中相同的吸收峰，说明MIP中的模板分子已基本上洗脱干净。

2.5.2 扫描电镜分析 图7为NIP(a)和MIP(b)的扫描电镜图，NIP和M IP都形成了粒径较为均一的微球，NIP微球表面光滑，MIP微球表面相对于NIP微球表面较为粗糙，出现明显的凸凹不平的坑，比表面积比NIP的比表面积要大，比表面积的变大有利于吸附量的增加。比较两者微球的平均粒径可知，MIP的粒径比NIP大，这很可能是由于MIP在合成过程中添加了模板，经过溶胀聚合、模板洗脱后在微球表面和内部形成很多印迹“孔穴”，这些“孔穴”占据一定的体积，使得微球外观表现为粒径变大［19］。

图7 NIP(a)和MIP(b)的扫描电镜图Fig.7 The scanning electronmicrograph of NIP(a)and MIP(b)

3 结论

采用沉淀聚合法，以染料木苷和大豆苷含量总和为89.2%的大豆异黄酮为模板分子，4－VP为功能单体，EGDMA为交联剂，甲醇为致孔剂，AIBN为引发剂，合成了对大豆异黄酮具有类特异选择吸附能力的分子印迹聚合物微球。紫外光谱法确定了4－VP为功能单体，染料木苷和4－VP的最适摩尔质量比例为1∶6。静态等温吸附实验表明，MIP的吸附量明显高于NIP，对染料木苷和大豆苷具有较高的特异吸附量。吸附动力学实验表明，5h时，MIP和NIP对染料木苷和大豆苷的吸附量达到吸附平衡。类特异选择性实验表明，MIP对大豆异黄酮类物质具有明显的类特异选择吸附性能，对具有典型大豆异黄酮母环结构的物质具较高的识别能力。红外光谱和扫描电镜表明M IP中形成了固定的功能基团和用于识别模板分子的印迹孔穴。此MIP有望在大豆异黄酮类物质的富集、分离、纯化、固相萃取、色谱分离以及工业制备大豆异黄酮特异吸附材料方面得到进一步的应用。

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Preparation and characteristics of soy isoflavone class－specific molecularly im print polymerm icrospheres based on two tem plates

LIChao1，SHIBo2，ZHANG M eng－ke1，STAORU Nirasawa3，CHENG Yong－qiang1，*
(1.Food Sciense and Nutritional Engineering College，China Agricultural University，Beijing 100083，China; 2.Feed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China; 3.Japan International Research Center for Agricultural Sciences，Tsukuba 305－8686，Japan)

The soy isoflavone molecularly im p rint polymer m icrospheres was synthesized by p recipitation polymerization in order to develop a new way of soy isoflavone enrichment and separation.Methods using soy isoflavone that the total contents of genistin and daidzin in soy isoflavone were 89.2 percents were used as tem p late molecular，4－vinyl pyrid ine(4－VP)were used as the functionalmonomer，ethylene g lycol dimethacrylate (EGDMA)were used as the c ross－linking agent，azod iisobutyronitrile(AIBN)were used as initiator.The characteristics of soy isoflavone c lass－specific molecularly im p rint polymer m icrospheres were evaluated by means of static and dynam ic adsorp tion experiments，also by c lass－specific selec tive experim ents，structure and shape charac terization research m ethod.UV spec tromertry was em p loyed to demonstrate the mechanism of the interac tion between tem p late m olecular and four kinds of functionalm onomers.The results showed that the 4－VP interac ted powerfully w ith the tem p late molecular and the interac tion effect was bestwhen the m ole ratio was 1∶6 between the temp late molecular and the 4－VP.The static adsorp tion experiments results showed that MIP had a good specific adsorp tion effect com pared w ith NIP.The dynam ic adsorp tion experiments results showed that the polymerm ic rospheres would reach to saturated adsorp tion in 5h.The c lass－specific selec tive experiments results showed that M IP had a good c lass－specific selec tive effec t and also a high absorp tion to various com ponents of soy isoflavone.This molecularly imp rint polymerm icrospheres are expected to be further research and app lication in the further in enriching，separating and checking the soy isoflavones.

genistin;daidzin;c lass－specific;polymerm icrospheres

TS201.2

A

1002－0306(2012)19－0053－05

2012－03－30 *通讯联系人

李超(1987－)，男，硕士，研究方向:天然产物与功能食品。

国家自然科学基金项目(30972286，31171628);北京市优秀人才培养计划(2011D009007000001)资助。