响应面优化南瓜果肉多酚提取工艺及抗氧化性能研究

郭 涛，马重华，王 雅，*，周尚臻，刘荟萃，赵春萌

（1.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050；2.兰州理工大学石油化工学院，甘肃兰州 730050）

响应面优化南瓜果肉多酚提取工艺及抗氧化性能研究

郭 涛1，马重华2，王 雅1，*，周尚臻1，刘荟萃1，赵春萌1

（1.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050；2.兰州理工大学石油化工学院，甘肃兰州 730050）

对南瓜果肉多酚提取工艺及抗氧化性能进行了研究。通过单因素实验和响应曲面实验，研究超声功率、超声时间、乙醇浓度和料液比对南瓜果肉多酚提取效果的影响；通过还原力和DPPH自由基清除法对南瓜果肉多酚的抗氧化活性进行研究。实验结果表明，南瓜果肉多酚最佳提取工艺条件为：超声功率237.2W、超声时间11.65min、乙醇浓度96.80%、料液比为1∶21.4（g/mL），此条件下实际南瓜果肉多酚得率为5.629%；四个因素对南瓜多酚得率影响的主次顺序为：超声时间＞乙醇浓度＞料液比＞超声功率；南瓜果肉多酚具有一定还原力和清除DPPH·的能力，且在一定范围内，多酚浓度与其抗氧化活性呈明显的线性关系。

南瓜果肉多酚，超声波辅助提取，响应曲面设计，抗氧化性能

南瓜是葫芦科南瓜属一年蔓性草本科植物，现代医学研究发现南瓜含有多种生理活性物质，具有很高的药用价值，已被国内外公认为特级保健品，是集食品、保健品、药品为一身的营养保健品[1]。南瓜的功能成分研究有环丙基氨酸、南瓜多糖、南瓜粗纤维、β-胡萝卜素、果胶、南瓜葫芦巴碱等[2]。目前，对南瓜果肉多酚的研究未见报道，本实验应用周期短、精度高的响应面实验设计[3]优化了南瓜果肉多酚的提取工艺，并对其抗氧化活性进行研究，为南瓜果肉多酚的研究提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南瓜（冠龙F1） 2011年6月购自兰州西太华超市，南瓜洗净后，将其果肉真空冷冻干燥，粉碎后过0.38mm筛；二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）、没食子酸 分析纯，Sigma-Aldrich；VC分析纯，天津市医药工业技术研究所；硫酸锂 分析纯，天津市天河化学试剂厂；铁氰化钾 分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司；氯化铁 分析纯，天津市双船化学试剂厂。

UV-9200紫外可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；FD-1-55真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 福林酚试剂（FC试剂）的制备 在1L磨口回流蒸馏器中加入50g钨酸钠、12.5g钼酸钠、350mL蒸馏水、85%磷酸25mL和37%盐酸50mL，冷凝回流10h，之后取下冷凝管，添加75g硫酸锂和3滴双氧水，重新加热至沸，维持15min，除去多余双氧水后冷却，然后用蒸馏水定容至500mL，并转移至棕色试剂瓶中置于冰箱中4℃冷藏备用（使用前稀释10倍）。

1.2.2 没食子酸标准曲线的建立[4]准确称取0.2500g没食子酸，用70%乙醇溶液定容至50mL，分别移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5mL上述没食子酸标准液到50mL容量瓶中，用蒸馏水定容，制得质量浓度为0、0.05、0.1、0.15、0.25、0.5mg/mL的没食子酸溶液，从上述不同浓度的标准溶液中吸取0.5mL到50mL比色管中，加入1mL FC试剂，在0.5～8min内加入5mL碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至25mL并混合均匀，室温下放置60min后在765nm处测吸光值。每个浓度做3个平行实验，取平均值，绘制标准曲线。吸光度值Y与没食子酸标准溶液质量浓度X（mg/mL）之间的回归关系为：Y=1.1805X+0.0278，R2=0.9921。

1.2.3 南瓜果肉多酚的提取[5]称取南瓜果肉粉2.000g，按一定体积分数的乙醇和一定的料液比、超声功率、超声时间进行超声提取后，5000r/min离心10min，取上清液测其多酚含量并计算多酚得率：

式中：m为样液中南瓜果肉多酚质量（g）；M为南瓜果肉质量（g）。

1.2.4 南瓜果肉多酚超声辅助提取的单因素实验[6-7]

分别研究乙醇浓度、超声功率、料液比和超声时间对南瓜多酚得率的影响。

1.2.5 响应曲面法实验设计[8]在单因素实验的基础上，综合考虑各因素对南瓜果肉多酚得率的影响，采用统计分析软件Design-Expert 7.1.4建立4因素3水平的Box-Behnken模型，通过实验确定最优提取工艺。以南瓜果肉多酚得率（%）为响应值，超声功率（X1）、超声时间（X2）、乙醇浓度（X3）、料液比（X4）为自变量，变量编码值根据式（2）确定。

表1 实验设计因素和水平编码值Table 1 Factors and levels of experiment design

其中χi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为实验中心点处自变量的真实值，△X为自变量的变化步长。4个自变量因素编码及水平见表1。

1.2.6 南瓜果肉多酚的纯化 将南瓜果肉多酚提取液经NKA-9大孔树脂纯化，冷冻干燥，测得其多酚纯度为84%，进行抗氧化活性研究。

1.2.7 南瓜果肉多酚抗氧化活性的测定 还原能力测定[9]和DPPH·清除能力[10-11]的分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声功率对南瓜果肉多酚得率的影响 在超声时间10min、料液比1∶16、乙醇浓度60%的条件下，研究超声功率对南瓜果肉多酚得率的影响。如图1所示，随着超声功率的增大，多酚得率增大，当超声功率达到240W时多酚得率最高；而当超声功率大于240W时多酚得率开始降低。在一定时间内，超声功率越高，体系升温越快，固液扩散速度也越快，有利于物料中有效成分的浸出；但超声功率过高，体系温度升高导致多酚类物质降解，从而使多酚得率下降。所以最佳超声功率为240W。

2.1.2 超声时间对多酚得率的影响 在超声功率240W、乙醇浓度60%，料液比1∶16的提取条件下，研究超声时间对多酚得率的影响。从图2可以看出，当超声时间为10min时多酚得率最高，继续延长提取时间，多酚得率开始下降，这可能是因为提取溶剂温度的不断升高以及提取时间的延长，导致多酚类物质降解，从而使多酚提取率下降。另外，时间越长，耗能越大，所以取最佳超声时间为10min。

图2 超声时间对多酚得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on yield

2.1.3 乙醇浓度对多酚得率的影响 在超声时间10min、超声功率240W、料液比1∶16的提取条件下，研究乙醇浓度对多酚得率的影响。如图3所示，随着乙醇浓度的增大，多酚得率呈上升趋势，当乙醇浓度为95%时，南瓜果肉多酚得率最大，若再继续增大乙醇浓度，多酚得率有所下降，因此，最佳乙醇浓度为95%。在乙醇溶剂中多酚类物质处于游离状态，增加了组织的通透性，得率最高，也可能是由于南瓜果肉中醇溶性多酚含量较多。

图3 乙醇浓度对多酚得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield

2.1.4 料液比对多酚得率的影响 在超声时间10min、超声功率240W、乙醇浓度95%的提取条件下，研究料液比对多酚得率的影响。图4表明，随着料液比的增大多酚得率提高，当料液比为1∶20时多酚得率达到最高，再继续增大时呈下降趋势。这可能是因为料液比为1∶20时，溶剂对多酚的溶解已经达到了饱和，继续增大溶剂用量，并不能显著提高多酚的提取量，因此选最佳液料比为1∶20。

图4 料液比对多酚得率的影响Fig.4 Effect of ratio of materiel to solvent on yield

2.2 响应曲面优化实验结果

2.2.1 模型建立与显著性检验 运用Design Expert 7.1.4对表2实验数据进行多元回归拟合，获得响应值—多酚得率（Y）与4个因素二次多项式回归模型为：

由表3可知，模型P=0.0002<0.01，表明模型极其显著。模型的决定系数R2=0.8944，说明用该模型可以解释89.44%响应值的变化。该模型拟合程度良好，实验误差小，可以用此模型对南瓜果肉多酚提取工艺进行分析和预测。

由表4可知，一次项X2、X3，交叉项X1X3、二次项X12、X22、X32、X42对多酚得率的影响极显著，依据参数估计值可知影响因子的主效应主次顺序为：超声时间＞乙醇浓度＞料液比＞超声功率。

表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

表4 回归模型系数的显著性检验Table 4 Significance estimation of regression coefficients

为进一步确定最佳点的数值，对回归方程取一阶偏导数，并令其等于零，得如下方程：

求解得χ1=-0.07；χ2=0.33；χ3=0.36；χ4=0.28，代入编码公式得多酚提取的最佳工艺：X1（超声功率）=237.2W；X2（超声时间）=11.65min；X3（乙醇浓度）=96.80%；X4（料液比）=1∶21.4（g/mL）。

2.2.2 模型验证 结合回归模型的数学分析结果，超声波辅助提取南瓜果肉多酚的最佳工艺参数为：超声功率为237.2W，超声时间为11.65min，乙醇浓度为96.80%，料液比为1∶21.4（g/mL）。在此条件下南瓜果肉多酚理论得率为5.667%，实际南瓜果肉多酚得率为5.629%，两者非常接近，说明该模型可靠。

根据回归方程可以绘制各因素对多酚得率影响的响应面图和等高线图。等高线图同一曲线上多酚得率相同，图形中心多酚得率最高，从中心到边缘得率逐渐降低。等高线图沿某一因素轴方向曲线密度越大，说明多酚得率对该因素的变化越敏感，其影响因子越高，反映在响应曲面上则是曲面坡度越陡峭，反之，则其影响因子越小。等高线图的形状则可反映因素间交互作用的强弱，图形趋向椭圆且椭圆轴线与坐标轴的角度越大，则交互作用越明显，反之则交互作用越弱[12]。根据这些性质分析所有等高线图与相应曲面，可以得出各因素影响因子的排列为：超声时间＞乙醇浓度＞料液比＞超声功率，结果与2.2.1的参数估计结果相同。

图5所示在超声功率较低的条件下，乙醇浓度的变化能显著影响多酚的得率，而在高超声功率条件下，乙醇浓度对得率的影响明显减弱，这说明这两个因素之间存在拮抗作用，这与回归方程中的X1X3系数为负号相吻合。

图5 乙醇浓度和超声功率对多酚得率交互作用的响应面图Fig.5 Response surface of mutual-action for ultrasonic power and ethanol concentration on polyphenol content

2.3 南瓜果肉多酚的抗氧化性能

2.3.1 南瓜果肉多酚的还原力 由图6可知，南瓜果肉多酚具有一定的还原能力，且质量浓度在1.0～3.0mg/mL之间，其还原能力随质量浓度的增加而升高。

2.3.2 南瓜果肉多酚对DPPH·清除能力 图7表明，南瓜果肉多酚有一定的清除DPPH·的能力，且清除能力随着质量浓度的增加而增强。

图6 南瓜果肉多酚的还原力Fig.6 The reducing power of pumpkin pulp polyphenol of pumpkin pulp polyphenol

图7 南瓜果肉多酚对DPPH·的清除率Fig.7 Effect of scavenging DPPH·on pumpkin pulp polyphenol

3 结论

选用乙醇为提取剂，通过响应曲面实验优化南瓜果肉多酚的提取工艺，得到最佳提取条件：超声功率为237.2W，超声时间为11.65min，乙醇浓度为96.80%，料液比为1∶21.4（g/mL），此条件下实际南瓜果肉多酚得率为5.629%。方差分析结果表明，四个因素对多酚得率影响的主次顺序为：超声时间＞乙醇浓度＞料液比＞超声功率。体外抗氧化实验研究表明：南瓜果肉多酚具有较好的还原力和DPPH·清除能力，说明其具有较好的抗氧化活性，且在一定范围内，多酚浓度与其抗氧化活性呈显著的线性关系。

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Study on optimization of extraction technology for pumpkin pulp polyphenol by response surface method and its antioxidant activity

GUO Tao1，MA Chong-hua2，WANG Ya1，*，ZHOU Shang-zhen1，LIU Hui-cui1，ZHAO Chun-meng1
（1.College of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China;2.College of Petrochemical Technology，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China）

The extraction technology and antioxidant activity of pumpkin pulp polyphenol were studied.And influences of the ultrasonic power,ultrasonic time，ethanol concentration and solid-liquid ratio on the extraction of pumpkin pulp polyphenol were studied through single factor experiments and response surface experiment.The antioxidant activity of pumpkin pulp polyphenol was also studied by reducing power and DPPH radical scavenging method.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：ultrasonic power 237.2W，ultrasonic time 11.65min，96.80%ethanol，ratio of solid to liquid 1∶21.4(g/mL)，and under this conditions，the yield of polyphenol was 5.629%.The primary and secondary order of four factors affecting on extraction rate of pumpkin polyphenol were ultrasonic time>ethanol concentration>ratio of solid to liquid>ultrasonic power.Pumpkin pulp polyphenol possesses reducing power and activity to remove DPPH·，the concentration of polyphenol showed a linear relationship with its antioxidant activity to some extent.

pumpkin pulp polyphenol；response surface method；ultrasonic assisted extraction；antioxidation

TS255.36

B

1002-0306（2012）07-0315-05

2011－08－31 * 通讯联系人

郭涛（1976-），男，博士，讲师，主要从事食品、制药工程研究。

兰州理工大学“学科协调发展计划”资助。