选择性环氧化酶-2抑制剂塞来昔布抑制肿瘤生长的裸小鼠体内实验研究

倪志壮，张志广，李 熳

（天津医科大学第二医院消化内科，天津300211）

在过去的几年里人们认识到，非甾体类抗炎药（NSAIDs）在肿瘤化学预防中起着重要的作用。有证据表明，阿司匹林及其他NSAIDs类药物在消化道肿瘤中可能有预防性作用[1]。塞来昔布抑制胃癌形成的相关研究多从胃癌移植瘤出现后或诱导胃癌的同时予以干预的角度着手,本研究则从裸鼠植瘤前即开始应用不同剂量的塞来昔布灌胃干预的角度出发，观察塞来昔布对裸鼠移植瘤生长的抑制作用，并试图阐明这种抗肿瘤的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂和仪器 RPMI-1640培养基（天津百若克医药生物技术有限责任公司）；类标准胎牛血清（中美合资兰州民海生物工程有限公司）；LRH系列生化培养箱（上海一恒科技有限公司）；HJ-CJ-IFD型单人单面净化工作台（上海苏净实业有限公司）；阿拉伯树胶（北京索莱宝科技有限公司）。

1.1.2 实验动物与细胞株 5周龄BALB/c雄性去胸腺小鼠36只，体质量18~19 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号SCXK（京）2009-0004]。胃腺癌细胞系SGC7901购自天津市肿瘤医院。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物及细胞株处理 小鼠饲养于独立通气笼盒系统（Individually Ventilated Cages）的盒子中，所用垫木、饲料、饮水及笼盒均经过高压灭菌处理，笼外环境温度控制在25～28℃。胃腺癌细胞SGC7901在电热恒温培养箱中37℃、5%CO2、饱和湿度条件下，用含10%类标准胎牛血清的无菌RPMI1640传代培养。分离收集对数期细胞于同一无菌离心管中，用不含血清的无菌RPMI1640悬浮细胞浓度为 5×107/mL。

1.2.2 动物分组与给药方案 小鼠称重编号后，按照统计学随机数字表将动物随机分入A、B、C、D 4组，每组9只。A组（对照组）：阿拉伯树胶给药剂量为50mg/kg，灭菌双蒸水配制浓度为10mg/mL溶液。B组：塞来昔布给药15mg/kg溶于10mg/mL阿拉伯树胶溶液。C组：塞来昔布给药30mg/kg溶于10mg/mL阿拉伯树胶溶液。D组：塞来昔布给药60mg/kg溶于10mg/mL阿拉伯树胶溶液。4组动物习服3 d后于同一天灌胃给药，每天1次，每次0.1mL，灌胃第21天，4组动物由预实验同一操作人员在裸鼠右侧腋下皮下接种细胞悬液0.1mL/只（含细胞5×106个）行移植瘤建模，继续灌胃给药干预至实验结束。自实验开始每天观察小鼠饮食、活动、大小便及肿瘤生长情况，移植瘤建模第28天实验结束。

1.2.3 肿瘤测量与体积计算 游标卡尺记录4组小鼠植瘤后第7、14、21、28天肿瘤长、短径。肿瘤体积估算公式：肿瘤体积（mm3）=长径×（短径）2/2。分别计算各组小鼠肿瘤生长体积。

1.2.4 肿瘤组织处理 实验第28天裸鼠称重、测长短径后颈椎脱臼法处死小鼠，立即剥取肿瘤并浸入10%甲醛固定蜡块包埋后切片。

1.2.5 方法 免疫组织化学（PV9000）染色法检测各组组织Ki-67、Bcl-2表达，鼠抗人Ki-67、鼠抗人Bcl-2单克隆抗体及PV-9000二步法免疫检测试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司。严格按照试剂盒说明书进行操作。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗做阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。

1.2.6 结果评定标准 光学显微镜下观察组织切片，高倍镜下（×200）随机观察不少于5个视野，不少于1 000个肿瘤细胞计数。Ki-67蛋白表达于细胞核，以细胞核呈现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达，Ki-67染色程度评分参照许良中等[2]所述：基本不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。细胞核阳性数目百分率：阴性为0分，≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；Bcl-2的蛋白表达评分参照吴军[3]评分标准，Bcl-2的蛋白于细胞浆，以胞浆呈棕色颗粒为阳性表达，Bcl-2染色程度评分：基本不着色为0分，着色淡为1分，着色深为2分。着色细胞占计数细胞的百分率：0～5%计为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。将两组每张切片染色程度与染色细胞百分率得分乘积作为最后得分。

1.3 统计学分析 选用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料结果所有数据均以表示，采用One way-ANOVA分析，组间比较采用Dunnett’s法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物实验 36只小鼠参与实验，移植瘤成瘤率100%，实验整个过程中小鼠饮食、活动等情况良好，未观察到血尿、血便等异常，至实验结束时小鼠全部存活。实验开始至结束时所测各组小鼠体质量数据差异无统计学意义。

2.2 塞来昔布对裸鼠移植瘤生长的影响 由表1可见，塞来昔布可以抑制移植瘤生长，与A组对照组比较，B、C、D 3组实验组移植瘤体积从第7天即表现出差异（P<0.001）；至植瘤后28 d实验结束，实验组较对照组对移植瘤生长均保持抑制，移植瘤体积有差异（P<0.001）。组内比较：B、C、D 3组在植瘤后第 14 天移植瘤体积有差异（B∶C，P<0.01，B∶D，P<0.001，C∶D，P<0.01），表现为 D 组较 B 组、C 组对移植瘤生长抑制作用更为显著（B∶D，P<0.001，C∶D，P<0.01），这种抑制作用一直到实验结束。

表1 塞来昔布对裸鼠移植瘤生长的影响(n=36，mm3)Tab 1 Effectof celecoxib on thegrow th of xenografts(n=36，，mm3)

表1 塞来昔布对裸鼠移植瘤生长的影响(n=36，mm3)Tab 1 Effectof celecoxib on thegrow th of xenografts(n=36，，mm3)

B、C、D 3组分别与A组比较△P<0.001；B组与C组比较▲P<0.01，B组与D组比较★P<0.001；C组与D组比较茛P<0.01

塞来昔布浓度/[mg/（kg·d）]0（A 组）15（B 组）30（C 组）60（D 组）F 21 d 577.45±60.83 423.93±36.06△▲★316.79±29.26△茛215.41±25.84△132.347 14 d 214.17±24.28 125.02±16.23△▲★90.45±10.08△茛48.36± 8.19△174.977 7 d 26.88±5.03 15.75±2.31△★13.59±2.74△茛8.81±1.54△52.072 28 d 1 397.24±228.69 787.68± 95.73△▲★627.72± 47.30△茛532.25± 51.91△98.762

2.3 细胞Ki-67与Bcl-2表达 见表2。Ki-67阳性细胞为细胞核呈棕黄色或棕褐色染色（图1）。本次实验结果表明，与对照组比较，塞来昔布30mg/（kg·d）及塞来昔布60mg/（kg·d）能抑制Ki-67表达；组内比较有差异（B∶C，P<0.05；B∶D，P<0.05；C∶D，P<0.01），塞来昔布在本次60mg/（kg·d）较塞来昔布15mg/（kg·d）、30mg/（kg·d）更能抑制Ki-67表达（B∶D，P<0.05；C∶D，P<0.01）。Bcl-2 阳性细胞为细胞质棕色染色（图2）。A组与B、C、D 3组分别比较有差异（P<0.001），组内比较无差异（P>0.05），塞来昔布可抑制Bcl-2蛋白表达。

表2 细胞K i-67与Bcl-2表达(n=36)Tab 2 Exp ression of K i-67 and Bcl-2(n=36)

表2 细胞K i-67与Bcl-2表达(n=36)Tab 2 Exp ression of K i-67 and Bcl-2(n=36)

Ki-67：C、D组分别与A 组比较◆P<0.01；B组与C组比较，■P<0.05，B组与D组比较，襋P<0.001；C组与D组比较□P<0.01；Bcl-2：A组与B、C、D 组比较●P<0.001，组间比较●P>0.05

Ki-67 4.05±0.18 3.89±0.18■襋◣3.60±0.16◆□2.83±0.47◆35.288塞来昔布/[mg/（kg·d)]0（A 组）15（B 组）30（C 组）60（D 组）F Bcl-2 0.92±0.05 0.78±0.04●0.75±0.06●0.74±0.05●26.273

3 讨论

目前已发现的环氧化酶（COX）有两种：结构型酶环氧化酶-1（COX-1）和诱导型酶环氧化酶-2（COX-2）。COX-1产生的前列腺素参与胃黏膜的保护、血小板的聚集、血管内平衡、维护肾脏的钠水平衡等生理功能，COX-2产生的前列腺素主要干预炎症反应以及参与细胞增殖的某些过程[4]。COX-2对于炎症反应和肿瘤过程而言都是一个重要的因素，COX-2在大多数的上皮细胞不表达或表达很低，但是在炎症病变及多种癌前病变和肿瘤中高表达，因此这也是作为肿瘤和炎症的预防以及治疗的靶点[5]。

有研究表明非甾体类抗炎药（NSAIDs）可以降低食管癌[6]、结肠癌[7]等肿瘤的发病风险。由于NSAIDs对COX抑制无选择性,导致临床应用阿司匹林、吲哚美辛等非选择性COX抑制剂引起如胃溃疡、出血等上消化道不良反应，目前认为这些不良反应的产生主要由于抑制COX-1引起，因此长期应用此类药物用于抑制肿瘤生长将不够理想。塞来昔布是第一个进入临床的选择性COX-2抑制剂，拥有与NSAIDs相似的抗炎、止痛效果，但没有NSAIDs抑制COX-1所引起的上消化道不良反应[8]。COX-2在胃癌及癌前病变中表达升高，并且COX-2表达阳性的胃癌患者预后不良[9]。

细胞的增殖和凋亡是维护细胞和组织平衡的重要机制。胃癌的发生发展与细胞过度增殖及细胞凋亡异常相关[10]，同时具有抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞的凋亡作用而安全性好的药物更值得进一步探寻。Ki-67抗原为存在于细胞核的一种非组蛋白性核蛋白，是与细胞增殖相关的核抗原[11]，阳性率能反映细胞增殖的情况，因此，Ki-67表达降低也表明细胞增殖受到抑制。张宏玲等[12]体外研究表明，塞来昔布能够抑制胃癌细胞SGC7901生长。Yashiro等[13]研究发现，应用选择性COX-2抑制剂可以抑制胃癌细胞系OCUM-2M及NF-21 COX-2及Ki-67的表达。Jun等[14]研究发现，塞来昔布预防用药可以抑制N-甲基-硝基-N亚硝基胍诱导的Wistar大鼠胃癌的发生，并且抑制肿瘤细胞Ki-67的表达，成剂量依赖性的增加肿瘤细胞的凋亡。本实验从体内研究角度进一步证实了选择性COX-2抑制剂塞来昔布可以抑制移植瘤生长，降低移植瘤Ki-67表达，间接表明塞来昔布具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，这种抑制作用呈剂量依赖性，本实验中，低剂量塞来昔布组（15mg/kg）Ki-67的表达与对照组比较未体现差异（P>0.05），可能与本次实验塞来昔布所用浓度较低有关。

塞来昔布有包括抗肿瘤在内的多种作用，大量研究表明塞来昔布可以通过调节Bcl-2家族成员的表达及线粒体途径介导细胞的凋亡[15]。崔京远等[16]研究发现，塞来昔布可以抑制SGC7901增殖，抑制Bcl-2表达。孙现军等[17]研究结果表明，选择性COX-2抑制剂塞来昔布作用于SGC7901细胞呈剂量依赖性下调COX-2及Bcl-2蛋白的表达，诱导细胞凋亡。Bcl-2即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因，为一种原癌基因，正常及病理情况下，Bcl-2有抑制细胞凋亡功能[18]，因此促进细胞Bcl-2表达的下调也利于促进细胞的凋亡。本次实验Bcl-2免疫组化结果表明，塞来昔布可以下调Bcl-2蛋白的表达，促进肿瘤细胞凋亡，实验组内免疫组化结果比较Bcl-2蛋白的表达无差异（P>0.05）。

本次研究表明，塞来昔布可抑制移植瘤生长，表现出显著的抗肿瘤作用，这种作用与塞来昔布剂量相关，与张宏玲[12]、崔京远等[16]得出的结论一致，本次实验研究应用塞来昔布60mg/（kg·d）较塞来昔布15mg/（kg·d）、30mg/（kg·d）抑制肿瘤生长更显著，其抗肿瘤生长作用机制可能通过降低Ki-67表达从而抑制肿瘤细胞增殖、抑制Bcl-2表达促进肿瘤细胞凋亡途径实现。Susan等[19]动物实验表明，裸小鼠用塞来昔布（较低剂量为10mg/kg）灌胃给药24 h后，小鼠血内仍可测得塞来昔布存在，因此本次实验塞来昔布抑制移植瘤生长作用考虑为造模前及造模后塞来昔布综合起作用的结果。

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