柱前衍生化高效液相色谱检测木糖液中葡萄糖含量

贾鹏禹，孙蕊，李良玉，李洪飞，张桂芳，孙大庆，于伟

（1.黑龙江八一农垦大学黑龙江省农产品加工工程技术研究中心，大庆163319；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院）

木糖为白色细针状结晶或结晶性粉末，作为无热量的甜味剂，其食用功能和生理功能较强，利用价值极高[1-4]。工业制得结晶木糖后，产生大量廉价木糖母液。近两年，模拟移动床（SMB）分离技术成为木糖母液分离木糖的重要手段[5-6]，深受众多企业推崇。在进入SMB色谱之前需要检测料液中葡萄糖含量，用以评估发酵效果，调控发酵工艺。

目前关于复杂体系中单糖检测尚缺少普适的HPLC检测方法，专用糖柱（配体交换分离）价格昂贵、易损耗且样品前处理烦琐[7]，最近几年出现的蒸发光散射（ELSD）和电雾式（CAD）检测器[8-9]，亲水作用色谱（hilic）[10-11]等新技术仍未得到有效普及。研究发现，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）是一种具有强紫外吸收的衍生试剂，Honda等[12]发现该试剂可以与还原性糖在温和条件下反应，产物无立体异构体且在紫外245 nm处有强烈的吸收。鉴于该物质的特性，采用它对葡萄糖进行柱前衍生，建立了木糖母液及其发酵液中葡萄糖的柱前衍生化高效液相色谱检测方法，收到了令人满意的结果。

1 实验部分

1.1 仪器

高效液相色谱仪（型号：1200美国Agilent公司），配备：G1310A四元梯度泵、G1365D多波长紫外检测器、G1362A示差折光检测器、G1329A恒温自动进样器、G1322A在线脱气机、G1316A柱温控制单元、chemstation色谱工作站；电子分析天平（型号：ML104瑞士梅特勒公司）；多功能酸度计（型号：S40瑞士梅特勒公司）。

1.2 试剂

乙腈、甲醇（色谱纯）；三氯甲烷、乙酸铵、乙酸、氢氧化钠（分析纯）；PMP（99%，ACROS公司）；葡萄糖、D-木糖、阿拉伯糖（分析纯）。实验所用水为超纯水，其他试剂均为国产色谱纯或分析纯试剂；木糖母液购自吉林某糖企业、木糖发酵液由母液经实验室发酵条件模拟。

1.3 PMP衍生产物的制备

1.3.1 标准品衍生化

准确称取葡萄糖溶于NaOH/水溶液（0.3mol·L-1）中配制一系列标准溶液，分别取该溶液200μL与200μL的PMP/甲醇溶液（0.3mol·L-1）混合，在70℃下水浴30min；取出后冷却至室温，然后加入200μL的HCl溶液（0.3 mol·L-1）中和，分3次每次1 mL氯仿萃取反应液后，留取水相溶液经0.45μm的滤膜过滤，进样量10μL进行HPLC分析；外标法定量。

1.3.2 样品前处理

参照1.3.1过程，取样品1mL用NaOH/水溶液（0.3 mol·L-1）稀释至一定倍数（依据样品总糖浓度结合线性范围规定稀释倍数），取该稀释液200μL与200μL的PMP甲醇溶液充分混合，在70℃下水浴30min，取出后冷却至室温，然后加入200μL的HCl溶液进行中和，同体积氯仿萃取后，水相溶液经0.45μm的滤膜过滤进行HPLC分析。

1.4 HPLC条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，150 mm×4.5 mm ID，5μm（美国Agilent公司）；流动相：95%A（醋酸盐缓冲液，0.1mol·L-1，pH=5.71），5%B（乙腈）；流速：1 mL·min-1；柱温：30℃；UV检测波长：245 nm（带宽50 nm）；进样量：10μL。

2 结果与讨论

2.1 方法适应性

图1（a）为木糖母液样品色谱图，可以看出，葡萄糖衍生物谱峰位置（Glu箭头所示）在6.2 min，全部分离在10 min内完成，目标峰位无干扰；图1（b）为木糖发酵液样品色谱图，Glu箭头处显示葡萄糖衍生物谱峰消失，证明木糖发酵液中葡萄糖已被发酵消除（发酵36 h样品）。图2是采用配体交换分离-示差检测得到的同样品色谱图，其方法采用了Rezex RCM-Monosaccharide Ca+2（8%），300×7.8色谱柱（美国Phenomenex公司），全水流动相，示差检测器，样品经脱色和离子交换处理。由图可见，Glu箭头所指发酵液中葡萄糖峰位（10.9 min）已回落基线（主图），佐证了采用的方法的可靠性。但此法所用色谱柱价格昂贵，色谱柱易污染，保护柱消耗大，对操作要求苛刻，前处理需样量大，过程烦琐，检测费用高，不适合用作常规快速检测。

2.2 衍生方法的选择

在相似的衍生化方法研究中，首先是将样品溶液真空干燥，再用水溶解，萃取完成后的水相再一次进行真空干燥，最后的干燥物用水溶解进行HPLC的分析。这些步骤目的一是除去衍生反应中剩余的试剂和产生的杂质，二是针对组分含量少的样品有利，但无法避免各步骤中衍生产物的损失，其步骤的复杂性不利于方法的移植。因此，实验直接将待测样品和标准品溶解于NaOH溶液中以获得衍生环境，衍生操作时移取一定量溶液直接进行衍生，衍生后提取水相直接进样。

2.3 衍生样品稳定性

从酸中和后开始计时，于1、3、5、7、9、11、13、15和36 h时取样分析，以葡萄糖衍生物峰高（H）为参考值，考察了葡萄糖衍生物的稳定性。实验发现，15 h内葡萄糖衍生物峰高的相对偏差小于1%，能够满足过夜分析的要求。但在第36 h测定时，衍生物峰高有所降低，峰高较均值的减小6.73%。实验结果见表1。

2.4 有机萃取剂的选择

表1 衍生物稳定性Table1 The stability of derivative

柱前衍生使用的过量衍生试剂（PMP）须在样品进入HPLC之前加以除去，以消除其对分离产生的影响。实验分别选取苯、氯仿、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、正己烷作萃取剂进行残留消除实验。对衍生的最后产物使用同体积的不同有机试剂进行萃取，比较了5种有机萃取剂去除杂质的效果。结果证明5种有机试剂中，氯仿在PMP去除和葡萄糖衍生物回收两方面的作用效果最佳。其总使用量为衍生液的5倍（体积比）时，三次萃取后PMP仅剩1%，Glucose-PMP的回收率可达到91.7%，此过程要求在细径试管（5 mL）内完成，以方便有机相的提取，每次萃取液震荡混匀后需静止3min。

2.5 方法精密度、标准曲线与检测限

按照1.3.2平行制备样品，执行1.4色谱条件，考察方法精密度，葡萄糖的精密度（RSD，n=5）为：1.53%；采用外标法对葡萄糖进行线性考察：精确称取标准品，经NaOH溶液溶解并配制成一系列的工作溶液，衍生处理后依次进样，根据峰面积A对糖浓度C（mg·L-1）进行线性回归，依据三倍噪声计算检测限。结果见表2。2.6样品测试结果

表2 线性回归方程Table2 Linear regression equations

实验对6个不同批次的木糖母液及其发酵液（酵母菌，发酵时间12 h和24 h）中葡萄糖含量进行了检测。结果表明母液中葡萄糖经优化的发酵条件处理后，其含量在12 h后急剧减少，24 h后多已消耗完全，见表3。

表3 样品测定结果Table3 Test results of samples

3 小结

通过PMP柱前衍生化反相HPLC，实现了利用紫外检测器和C18柱检测木糖母液和发酵液中的葡萄糖含量，克服了以往使用糖分析专用柱的不足，简便普适，灵敏度更高，可靠性更好；此法可为木糖母液发酵工艺的控制提供准确的数据。深入的研究证明，在该方法的基础上采取合适的梯度洗脱，可用于分析木糖母液的单糖组成，可对进一步研究木糖母液的发酵及SMB色谱分离过程提供重要依据。

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