木通皂苷D在不同pH值和温度下的稳定性

徐国防 李 爽 刘长缨 李晓苏

1.郑州人民医院医务科，河南郑州 450003；2.河南省人民医院呼吸内科，河南郑州 450000

木通皂苷D在不同pH值和温度下的稳定性

徐国防1李 爽1刘长缨1李晓苏2▲

1.郑州人民医院医务科，河南郑州 450003；2.河南省人民医院呼吸内科，河南郑州 450000

目的研究木通皂苷D在不同的pH值和温度下的稳定性。方法 采用高效液相色谱法测定不同pH值的磷酸盐缓冲液中木通皂苷D浓度。 结果 方法的精密度（相对标准偏差，RSD）≤6.4%，准确度（相对误差，RE）≤±4.7%。木通皂苷D在中性和弱碱性的环境中比较稳定，但在强酸和碱性环境中易分解，其降解速率还随温度的升高而加快。结论 试验表明木通皂苷D的降解具有pH值和温度依赖性，其在室温条件下的稳定性可以满足分析测定的需求。

木通皂苷D；稳定性

木通皂苷D是中药续断中的主要有效成分之一，其含量达2%以上[1]。续断具有预防和治疗骨质疏松症，促进骨愈合等疗效[2]，最早见于《神农本草经》，其应用已有数千年的历史[3-6]。此外，它还具有抗氧化、抗炎、免疫调节作用[7-8]。

木通皂苷D的分子结构中有一个酯键，而酯键常常是不稳定的，尤其是在酸性或碱性条件下，已有关于此酯键在220℃断裂的报道[9]。见图1。为了更好地理解其物理和化学性质，进一步研究和开发木通皂苷D和续断药材，本资料采用高效液相色谱法测定了木通皂苷D在不同pH值的磷酸盐缓冲液中的降解速率，并考察了温度对降解速率的影响。

图1 木通皂苷D在220℃下的降解反应

1 资料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-10 AT型液相色谱仪（日本岛津公司），SPD-10 A型紫外检测器（日本岛津公司），Anastar色谱工作站（天津奥特塞恩斯仪器有限公司）。木通皂苷D对照品（批号：111685-200401）和β-谷甾醇对照品（批号：110851-200403）均购自中国药品生物制品检定所。甲醇、乙腈均为色谱纯，其他为分析纯。

1.2 溶液配制

缓冲溶液：0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液若干份，分别用磷酸溶液或氢氧化钠溶液（11 mol/L）调节至 pH1.5、3.0、5.0、6.5、7.4、9.1 和 11.1，供试验用。

木通皂苷D溶液：用pH为1.5的磷酸盐缓冲液配制成含木通皂苷D 155 μg/mL的溶液若干份，分别于4℃、25℃、60℃、80℃水浴，每个温度水平双样本分析。

内标溶液：将β-谷甾醇对照品溶解在甲醇中制成0.4 μg/mL的溶液，4℃保存备用。

1.3 色谱条件与系统适用性[10]

色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-乙腈-水（20:35:45，v/v）；流速：1.0 mL/min；检测波长：205 nm；进样量：20 μL；柱温：室温。

在上述色谱条件下试验，理论塔板数按木通皂苷D和β-谷甾醇计算均不低于4 000，且无杂质峰干扰。

空白样品溶液试验：不含木通皂苷D和β-谷甾醇的磷酸盐缓冲液进样后色谱图见图3（A），可见，空白样品中在被测组分峰位上没有吸收峰，故对测定无干扰。在该条件下的典型色谱图见图2（B、C）。

1.4 测定方法验证

图2 木通皂苷D典型色谱图：（A）空白样品；（B）空白样品添加木通皂苷D（100 μg/mL）和内标（β-谷甾醇，0.4 μg/mL）；（C）pH为5.0的样品溶液在37 ℃水浴24 h后进样的色谱图

在上述条件下，木通皂苷D的线性范围为10～250 μg/mL，典型的线性方程为：Y=7.0×10-3X+1.8×10-2，r=0.998 6。木通皂苷D的定量下限（LLOQ）为2μg/mL。用低、中、高浓度分别为10、50、250μg/mL的质量控制样品溶液验证方法的日内和日间精密度（n=18），结果，其相对标准偏差分别≤5.9 %和6.4%（n=6）。方法的相对误差在±4.7 %范围内。

2 结果

2.1 酸度的影响

木通皂苷D在从1.5到11.1不同pH值的磷酸盐缓冲液中放置一定的时间，抽取适量测定，计算其浓度的自然对数值，绘制降解曲线，见图3。

图3 37℃下，木桶皂苷D在不同pH值溶液中的降解曲线

可见，在中性和弱酸性条件下，木通皂苷D是稳定的，37℃24 h内木通皂苷D的浓度几乎不下降。当pH值从6.5上升或者下降时，木通皂苷D的稳定性逐渐变差，在pH值1.5和11.1时，其t0.9分别为70.2 h和65.8 h。木通皂苷D在强酸和强碱条件下比中性和弱酸性条件下降解速率快，这与其他多数酯类相似。

2.2 温度的影响

pH1.5的缓冲溶液中，木通皂苷D在不同温度条件下放置一定时间，抽取适量测定，计算其浓度的自然对数值，绘制降解曲线。见图4。

可见，木通皂苷D随着温度的升高降解速率加快，而且在整个试验温度范围内，阿伦尼乌斯降解曲线基本为一条直线（r=0.999 6）。试验表明，温度能够影响木通皂苷D的稳定性，且低温条件下更稳定。

图4 pH1.5下，木桶皂苷D在不同温度条件下的降解曲线

3 讨论

川续断的主要结论成分是三萜皂苷，现已分离鉴定出23种三萜皂苷[11]。本资料采用高效液相色谱法测定木桶皂苷D，并用内标法进行定量分析，内标物在测定前即加入，不受存放条件的影响，分析方法准确可靠。有文献[9]报道木桶皂苷D在220℃酯键断裂，生成新的化合物，但在本资料所述试验条件下的降解产物没有确认，有待进一步研究。此外，使用不同加工方法处理续断，其中的皂苷D含量发生变化[12]，而本资料只考察了水溶液中木桶皂苷D的稳定性，这是因为本研究的目的是为药代动力学研究建立分析方法时做参考，也仅考察了温度和pH值对其稳定性的影响，这是由于二者是溶液中物质稳定性的最重要和最常见的影响因素，限于时间关系，没有进一步考察其他的影响因素。

[1]国家药典委员会.中国药典一部[S].北京：化学工业出版社，2000：231.

[2]杨中林.木通皂苷D在制备防治骨病药物中的应用：中国，1209116[P].2005年7月6日.

[3]程志安，吴燕峰，黄智清，等.续断对成骨细胞增殖、分化和细胞周期的影响 [J].中医正骨，2004，12（16）：705-707.

[4]石印玉.续断提取物治疗原发性骨质疏松症的多中心临床研究[C].中华医学会第三次全国骨质疏松和骨矿盐疾病学术会议暨骨质疏松诊断技术继续教育学习班论文汇编.杭州：中华医学会，2004：101.

[5]卿茂盛，邹志鹏.续断对大鼠骨质疏松愈合影响的生物力学实验研究[J].中国医学物理学杂志，2002，19（3）：159-160.

[6]郑志永.续断苷对人成骨细胞增殖和分化作用研究[J].山东中医药大学学报，2006，30（5）：388-389.

[7]程桂芹，孙少敏，王晓艳.川续断对D-半乳糖所致衰老模型小鼠抗氧化系统影响的实验研究[J].黑龙江医学科学，2001，24（5）：14-15.

[8]何雪心，裘军.续断提取物对小鼠D-半乳糖拟疾呆型的抗氧化作用[J].中国药师，2005，8（3）：185-187.

[9]Ryuichi Higuchi，Yoichi Kitamura，Tetsuya Komori.Thermal Degradation of Glycosides, I.Degradation of Typical Triterpenoid and Steroid Glycosides[J].Liebigs Annalen der Chemie，1986，1986（4）：638-646.

[10]高慧敏，王智民，付雪涛，等.RP-HPLC测定木通药材中皂苷类成分的含量 [J].中国药学杂志，2007，42（01）：20-23.

[11]王岩，周莉玲，李锐 .川续断的研究进展 [J].时珍国医国药，2002，13（04）：233-234.

[12]杨尚军 吴知行.川续断中三萜皂苷的研究[J].中国药科大学学报，1993，24（5）：272.

Stability of akebia saponin D at different pH value and temperatures

XU Guofang1 LI Shuang1 LIU Changying1 LI Xiaosu2
1.Medical department, People's Hospital of Zhengzhou City, Zhengzhou 450003, China; 2.Department of respiratory medicine, Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450000,China

Objective Stability of akebia saponin D was investigated in sodium phosphate buffers with different pH value and temperature.Methods Akebia saponin D in sodium phosphate buffers with different pH value and temperature was quantified using a high-performance liquid chromatography method.Results The precision of the method was within 6.4%(RSD) and the accuracy was within ±4.7%(RE).The akebia saponin D was stable in neutral and weak acidic conditions,but decomposed under strong acidic and basic conditions, which was pH- and temperature-dependent.Decomposition rate speeded up with the rise of temperature.Conclusion The results showed that the decomposition of akebia saponin D was pH- and temperature - dependent.The nine-tenths life is long enough for analyzing at room temperature.

Akebia saponin D;Stability

R914

B

2095-0616（2012）06-74-02

▲通讯作者

2012-02-01）