氧化苦参碱对局灶性脑缺血大鼠氧化应激反应的干预作用

包桂兰，陈 勇，于 玲，李 敏，陈 霞

(1.内蒙古民族大学医学院药理学教研室，内蒙古 通辽 028000； 2.吉林大学白求恩医学院药理系，吉林 长春130021)

氧化苦参碱(oxymatrine，OMT)是从豆科植物苦参、苦豆子和广豆根等中药中提取分离的一种喹喏里西啶类生物碱。OMT的药理作用广泛，有研究者[1-3]报道了OMT对于大鼠缺血性脑损伤的干预作用，然而其干预作用机制仍需进一步研究。大量研究[4-5]发现：氧化应激与组织损伤密切相关，为进一步研究OMT对脑缺血性损伤干预作用的机制提供了线索。目前国内外尚未见OMT对氧化应激反应干预作用的相关报道。本实验旨在通过观察OMT对局灶性脑缺血大鼠氧化应激反应的影响，初步探讨OMT对氧化应激反应的干预作用。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂与主要仪器雄性Wistar大鼠，体质量240～270 g，由吉林大学实验动物中心提供。OMT购自宁夏盐池紫荆花药业有限公司(批号T8852-5mg)；路路通注射液购自吉林省东北虎药业股份有限公司(批号D5879)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione-SH peroxydase，GSH-Px)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号770603)； 721分光光度计，南京第四分析仪器厂。LDZ5-2低速自动平衡离心机，北京医用离心机厂。SSW型电热恒温水槽，上海博讯实业有限公司。电子天平，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司。EG1160组织包埋机和Lecia Qwin图像分析仪，德国徕卡仪器有限公司。LKB-Ⅲ型超薄切片机，瑞典LKB公司。

1.2 大鼠局灶性脑缺血模型的制备利用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。大鼠用10%水合氯醛(300 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，固定于手术台上，切开右侧颈部皮肤，剥离气管及右侧颈总动脉(common carotid artery,CCA)上方的肌肉组织，分离并结扎右侧CCA，在此过程避免破坏与右侧CCA伴行的白色细长迷走神经，以防造成大鼠窒息而死。精细分离右侧颈外动脉(external carotid artery,ECA)和颈内动脉(internal carotid artery,ICA)，结扎ECA，并在ICA下方穿线备用。在右侧CCA分叉处上方约4 mm处剪口，将直径0.265 mm、长度约4 cm 的鱼线向大脑方向插入切口到颈内动脉中，当插入的鱼线最远端距右侧颈总动脉分叉处约18 mm为止。结扎ICA并缝合皮肤。术后37℃保温，待动物苏醒。

1.3 动物分组与给药动物购入后稳定1周，并保持饮食、饮水正常及昼夜节律正常。动物随机分为6组，即假手术组、模型组、阳性药对照组、OMT1(35 mg·kg-1)组、OMT2(70 mg·kg-1)组和OMT3(105 mg·kg-1)组，每组10只。各组动物在造模前5 d 预防性腹腔注射给药或生理盐水。其中阳性药对照组腹腔注射给予路路通注射液100 mg·kg-1。路路通注射液的有效成分为三七总皂苷，给药剂量以三七总皂苷的量计算。

1.4 神经学评分术后24 h观察大鼠状态，对大鼠进行神经功能学评分，以判定神经损伤情况及OMT干预作用。具体评分标准如下：0分，无神经功能缺失症状；1分，提尾时对侧前肢屈曲；2分，前肢屈曲对侧抵抗推力下降；3分，向对侧转圈；4分，向对侧转圈及意识障碍。

1.5 TTC染色测量脑组织梗死体积比实验动物麻醉、断头后取出完整的大脑并施行冠状切片，厚度约为2 mm。立即将切片置于1% TTC磷酸缓冲液中，37 ℃恒温水浴避光孵育5～10 min后取出，置于10 %中性甲醛中固定。TTC为白色粉末，在合适的温度及pH 值下可以与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶作用，将正常组织染成红色，而梗死区不被染色，故呈现白色。利用Leica Qwin图像分析仪计算脑梗死体积比，计算公式为：脑梗死体积比 = 脑片梗死面积之和×脑片厚度/脑片总体积。

1.6 HE染色及脑组织形态学观察将包埋脑组织的石蜡块用切片机切片，厚度为5 μm。石蜡切片浸入水中展开，将包含组织的石蜡切片剪下放在载玻片上。载玻片需事先用多聚赖氨酸处理以增加标本对载玻片的附着力。石蜡切片用二甲苯脱蜡5 min×2，梯度浓度乙醇水合，PBS缓冲液浸泡5 min×2后，放入苏木精染液浸染3～5 min；用PBS缓冲液冲洗后HE染色约10 min，用PBS缓冲液洗去多余染液。最后用梯度浓度乙醇脱水，二甲苯透明，滴加中性树胶封片。置10×20光镜下观察组织形态。

1.7 血清SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量检测大鼠脑缺血24 h后进行腹主动脉取血，3 000 r·min-1离心10 min，取血清分别按SOD、CAT、GSH-Px及MDA试剂盒说明书步骤操作，比色法测定吸光度(A)值后按公式计算出血清中各检测指标含量。

2 结 果

2.1 OMT作用后脑缺血大鼠神经学评分的变化大鼠脑缺血24 h后均表现不同程度的神经功能障碍。症状较轻的表现为左下肢无力、提尾时双侧前肢不对称伸展等症状；症状较重的表现为向左侧转圈甚至出现意识障碍。预防性腹腔注射OMT后，OMT3组大鼠神经学评分显著低于模型组(P<0.01)，OMT2组和OMT1组大鼠神经学评分均低于模型组(P<0.05)。见表1。

表1 OMT作用后脑缺血大鼠神经学评分和脑梗死体积比的变化

2.2 OMT作用后脑缺血大鼠脑梗死体积比的变化预防性腹腔注射OMT后，OMT3组大鼠脑梗死体积比显著低于模型组(P<0.01)，OMT2组和OMT1组大鼠脑梗死体积比低于模型组(P<0.05)。阳性药组大鼠脑梗死体积比与OMT2组相当，而OMT3组大鼠脑梗死体积比小于阳性药组(P<0.05)。见表1。

2.3 OMT作用后脑缺血大鼠脑组织形态学的变化光镜下观察：模型组大鼠脑梗死灶明显，缺血区部分神经元肿胀，体积变大，间质水肿明显，细胞及血管周围间隙显著增大；假手术组均无梗死灶，神经元结构形态正常，无细胞水肿及间质水肿；阳性药组大鼠梗死灶轻微，神经细胞形态基本正常，细胞间有一定程度的水肿；OMT1组大鼠神经细胞较为肿胀，有较为明显的间质水肿，坏死细胞数目较多，细胞及血管周围间隙较大；OMT2组大鼠梗死灶较轻微，细胞水肿程度也有一定程度减轻，细胞坏死程度减轻；OMT3组大鼠神经细胞及间质细胞的水肿程度较轻微，梗死灶较少，大部分细胞形态及结构完整清晰。见图1(插页二)。

2.4 OMT作用后脑缺血大鼠血清SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量的变化与模型组比较，OMT3组和OMT2组大鼠血清SOD活性明显增加(P<0.01)，且随着给药剂量的增加,SOD的活性增加;OMT1组大鼠血清SOD的变化不明显;阳性药组大鼠血清SOD活性与OMT3组和OMT2组相当。与模型组比较，OMT3组和OMT2组大鼠血清CAT活性明显增加(P<0.05)，且随着给药剂量的增加，CAT活性增加;OMT1组大鼠血清CAT的变化不明显。与模型组比较，OMT3组和OMT2组大鼠血清GSH-Px活性明显增加(P<0.01)，随着给药剂量的增加，GSH-Px活性增加；而OMT1组大鼠血清GSH-Px活性亦在一定程度上增加(P<0.05)。与模型组比较，OMT3组大鼠血清MDA含量明显降低(P<0.01)，OMT2组MDA含量也降低(P<0.05)，OMT1组降低程度不明显。见表2。

3 讨 论

脑血管疾病是危害人类健康的重要疾病，世界范围内的脑缺血患病和致残致死率一直居高不下，因此，对脑缺血的发生机理和药物治疗进行更深层次的探讨意义重大。研究发现：氧化应激是造成脑缺血损伤的重要病理生理机制之一。本研究结果表明：术前预防性给予OMT能够改善局灶性脑缺血大鼠的神经功能症状，促进术后大鼠神经功能的恢复，且具有较明显的量效关系，随给药剂量的增加，OMT降低大鼠术后神经学评分的作用逐渐增强。预防性给予OMT能够降低大鼠局灶性脑缺血时脑梗死体积比，并且具有较明显的量效关系，随着给药剂量的增加，OMT降低脑梗死体积比的作用逐渐增强。预防性给予OMT能够减轻缺血脑组织和细胞的水肿程度，减少梗死灶，维护脑组织和细胞的形态正常，从而降低局灶性脑缺血时脑梗死体积比。降低程度具有较明显的量效关系，随着给药剂量的增加，脑梗死体积比逐渐减小。

表2 OMT作用后大鼠血清SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量的变化

机体内承担消除自由基的任务的酶类主要包括SOD、CAT和GSH-Px[6-7]。这些酶再加上体内维生素C和维生素E等还原性小分子化合物，共同构成了抵御过氧化物和自由基损伤细胞和组织的屏障系统。因此，测定上述相关酶活性，就可以判定机体内发生氧化应激的程度以及清除自由基能力的大小。本研究依靠上述相关酶的催化性能，利用比色法，测定了各组大鼠血清的酶活力，通过测定大鼠外周血清的SOD、CAT和GSH-Px活性，评价OMT对脑缺血大鼠氧化应激的干预作用。结果表明：OMT可以提高SOD、CAT和GSH-Px活性，说明OMT可能通过抑制脑缺血时的氧化应激程度来干预脑缺血损伤。本研究中模型组大鼠外周血清的SOD、CAT和GSH-Px活性均较假手术组有明显下降，提示脑缺血诱发了脑组织氧化应激损伤；给予OMT后，3种酶的活性均有不同程度的恢复，有些组的恢复程度甚至超过了阳性药组，提示OMT对脑缺血大鼠的氧化应激有抑制作用，且呈现一定的量效关系。这可能是OMT发挥脑保护作用的机制之一。

另外，机体发生氧化应激时，生物膜中不饱和脂肪酸的氧化作用导致脂自由基的形成和延伸反应，而不饱和脂类双键的重排和膜脂的降解，形成了包括MDA在内的降解产物，测定血清MDA的含量可以间接反映脑组织中氧自由基水平和脂质过氧化反应的强弱。本研究中模型组大鼠血清MDA含量较假手术组有明显升高，提示脑缺血诱发了脑组织氧化应激损伤，并导致脂质过氧化作用的增强，而机体清除自由基的能力大为减弱；给予OMT后，MDA含量随着OMT剂量的增加而减少，证实其可以抑制MDA的生成，减轻机体过氧化损伤。

综上所述，OMT可以通过增强SOD、CAT和GSH-Px的活性和抑制MDA的生成而促进机体的自由基清除平衡，抑制自由基和脂过氧化物的聚集，进而保护线粒体免于遭受进一步的破坏，并最终发挥脑保护作用。

[参考文献]

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[2]张晓璐，刘 芬，黄 民，等.氧化苦参碱对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤保护作用的中枢机制[J].吉林大学学报：医学版，2008，34(2)：214-216.

[3]吕文伟，张晓璐，刘 芬，等.氧化苦参碱对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[J].中草药，2008，39(4)：579-582.

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