Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

张红艳，王春玉，姚 远，李彦姝，王 迪，李 丰

(1.中国医科大学细胞生物学教研室 卫生部细胞生物学重点实验室 教育部医学细胞生物学重点实验室 辽宁 沈阳 110001;2.辽宁省人民医院消化内科，辽宁 沈阳 110016)

转化生长因子β(TGF-β)超家族是一类作用繁多的细胞因子，参与细胞增殖、分化、细胞外基质改建及胚胎发育等多种细胞活动，并在多种疾病尤其是肿瘤、纤维变性类疾病及自身免疫性疾病的发病中扮演着重要角色[1-2]。TGF-β超家族包括TGF-β、骨形态发生蛋白(BMP)和活化素(activins)等亚类，可以通过激活多个下游信号通路行使其功能，其中Smads信号通路被认为是最关键的。Smads蛋白家族包括8个成员，分为R-Smads，Co-Smad和I-Smads 3类[3]。R-Smads包括Smad1/2/3/5/8，能够与受体结合并被受体磷酸化而激活；Co-Smad指Smad4，能够与活化了的R-Smads结合形成复合体，该复合体可进核结合DNA并与多种转录辅因子共同作用调控基因转录；I-Smads包括Smad6/7，作为R-Smads的竞争性抑制子，负向调控TGF-β通路。TGF-β信号通路受精密的调控，不同的上游配体激活不同的下游分子。TGF-β1属于TGF-β超家族的TGF-β亚类，Smad2/3/4参与该信号通路。Smad2/3/4在细胞质中与多种蛋白相互作用，如SARA[4]和PDK1[5]等。作为TGF-β1通路的重要下游蛋白，Smad2/3/4与某些相互作用蛋白的结合受TGF-β1调控。在TGF-β1作用下，PDK1与Smad2/3/4的结合减弱[5]；而Smad2与SARA的结合依赖于TGF-β1刺激[4]。本研究旨在利用基因重组技术构建pcDNA3.1myc-HisA Smad2/3/4真核表达质粒，使用标签抗体建检测Smad2/3/4在细胞中的表达，同时使用标签抗体进行免疫沉淀，质谱分析Smad2/3/4新的相互作用蛋白，进一步探索其生物学功能及在TGF-β信号通路中的功能。

1 材料与方法

1.1 菌株、细胞和质粒大肠杆菌DH5α感受态为本实验室制备；HEK293细胞为本实验室保存；pcDNA3.1myc-HisA载体购自Invitrogen公司，pcDNA3.1-Smad2/3受赠于Sabelle van Seuningen教授，pGEX2T-Smad4受赠于Koichi Shimada教授。

1.2 试 剂PyrobestTMDNA polymerase、dNTP、限制性核酸内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ均购自大连 TaKaRa公司；质粒提取及DNA电泳凝胶回收试剂盒购自Promega公司；DNA 和蛋白 marker购自GenScript公司；T4 DNA连接酶购自NEB公司；Myc抗体购自Santa公司；HRP标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥公司；引物合成和DNA测序测定由Invitrogen公司完成；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；DMEM及胎牛血清购自Gibco公司；ECL发光试剂盒购自GE Healthcare 公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 Smad2/3/4全长基因扩增设计Smad2/3/4扩增的PCR引物，并在引物中加入EcoRⅠ和KpnⅠ2个限制性酶切位点。引物序列见表1。以质粒为模板，利用pyrobest酶，通过PCR扩增，获得Smad2/3/4全长编码序列。

表1 引物序列及酶切位点

1.4 pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4表达载体的构建将pcDNA3.1myc-HisA载体和Smad2/3/4 PCR片段用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶回收纯化产物。回收产物摩尔比按照1∶5(载体∶片段 )比例，利用T4 DNA连接酶，将2个片段常温连接2 h，然后16℃连接过夜，取5 μL连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，涂于LB/Amp平板，37℃培养过夜。挑取菌落，接种于含氨苄西林的LB培养基中，37℃振荡过夜。一部分菌液用来保存菌种，另一部分用碱裂解法提取质粒DNA，用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定外源基因的插入，质粒DNA送Invitrogen公司进行测序分析。

1.5 pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4瞬时转染HEK293细胞系HEK293细胞用10%胎牛血清的高糖DMEM高糖培养基培养，细胞铺于6孔板至70% ～ 80%融合，按照Invitrogen公司提供的Lipofectamine 2000转染6孔板的说明书进行操作。

1.6 蛋白质提取与Western blotting鉴定转染24 h后，弃掉培养基，用PBS清洗2次。在细胞中加入60 μL含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，用橡皮刮刀将细胞缓慢刮下。收集所有液体至新的离心管中，冰上放置10 min，裂解细胞。13 000 g、4℃离心30 min，将上清转到新的离心管中，取上清5 μL，利用考马斯亮蓝G250染液和0.5 g·L-1BSA，绘制标准曲线，测量595 nm的吸光度(A)值，以结果做直线回归方程:Y = aX + b。测量蛋白样品与对照在595 nm的A值，差值代入标准曲线方程，求出相应蛋白浓度。

将蛋白定量后，取80 μg总蛋白经10% SDS-PAGE凝胶分离，4℃过夜，40 V恒压转移到PVDF膜上，5% 脱脂奶粉封闭1 h。用Flag抗体(1∶1 000稀释)室温孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(1∶5 000稀释)二抗孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。ECL显影，Western blotting成像系统采集图像。

2 结 果

2.1 PCR扩增Smad2/3/4基因全长以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板，特异性引物进行PCR扩增Smad2/3/4基因全长。扩增条件为95℃、5 min预变性；95℃、1 min，55℃、1 min，72℃、1 min，进行30个循环；72℃、10 min，温度降至4℃。1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色后，在紫外灯下观察结果。见图1。

2.2 重组质粒pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4的构建及鉴定每个质粒挑取2个克隆，将重组质粒pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后，图2中1和2泳道为Smad2，得到5 400和1 401 bp 的2条带；3和4泳道为Smad3，得到5 400和1 275 bp的2条带；5和6泳道为Smad4，5泳道得到5 400和1 656 bp的2条带，6泳道未得到目的片段。重组质粒的酶切鉴定表明质粒构建成功，经过测序分析，外源系列在NCBI-Blast比对结果与Smad2/3/4编码序列一致。

图1 Smad2/3/4基因PCR产物的扩增

图2 重组质粒pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4酶切分析

2.3 Western blotting检测蛋白表达分别将pcDNA3.1myc-HisA空载和pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4转染HEK293细胞，24 h后收集细胞，提取蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳，Western blotting检测蛋白表达，转染pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4，有一明显条带(图3)，空载体对照组未出现反应条带，结果表明构建的真核表达质粒在HEK293细胞中表达。

3 讨 论

TGF-β对上皮细胞生长有抑制作用。在肿瘤早期，可以抑制肿瘤的发生。但是，在肿瘤晚期，TGF-β1的生长抑制作用被限制，并通过引起细胞的上皮向间质转化促进癌细胞迁移和侵袭[6]。一些肿瘤中存在TGF-β信号通路蛋白(如TβRⅡ，Smad4)的突变，从而逃避TGF-β引起的生长抑制。利用细胞系进行研究发现：仅40%的胃癌细胞中存在TGF-β信号通路蛋白的突变，但在外源转入突变蛋白对应的野生型蛋白后，其中75%的细胞仍然不能恢复对TGF-β的反应性，这提示胃癌细胞内存在重要的TGF-β通路抑制因子。有学者[7-8]发现一些TGF-β通路的抑制因子，如在骨髓瘤中CDK2通过磷酸化Smad2的MH1区破坏TGF-β引起的转录调节功能；Cam kinaseⅡ通过磷酸化Smad2/3/4抑制TGF-β/Smads的转录调节功能；PKB通过结合Smad3抑制其转录活性及核转位。但是，还可能存在未被发现的TGF-β通路抑制因子。

图3 Western blotting检测pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4 融合蛋白在HEK293细胞中的表达

经典的Smads信号通路是TGF-β作为配体与相应膜受体结合，进而激活相应下游信号蛋白Smads，行使对应的生物学功能，形成一个严格而精密的信号网络。TGF-β1属于TGF 超家族的TGF 亚类，能够结合并激活细胞膜上的TGF-β受体Ⅱ(TβRⅡ)，活化的TβRⅡ进而结合并磷酸化同样位于细胞膜上的TGF-β受体Ⅰ(TβRⅠ，AKL5)。具有活性的受体复合体形成后，细胞质内的Smad2/3 C末端的SSXS序列被TβRⅠ磷酸化，与Smad4形成复合体，进入细胞核并行使基因转录调控功能[9]。

最近有研究表明：虽然经典的Smads作用是由R-Smads与Smad4形成复合体来完成，但也存在不依赖Smad4的情况。在角质细胞中，IKKalpha能够结合Smad2/3并促进Mad1、Mad2等介导TGF-β引起的细胞生长抑制基因的表达，这种促进不依赖于Smad4[10]。在造血干细胞中，核蛋白转录中介因子1γ(TIF1γ)能够与Smad4竞争和Smad2/3的结合，介导TGF-β/Smads引起的不同作用：Smad2/3-TIF1γ介导细胞分化，而Smad2/3-Smad4介导细胞的生长抑制[11]。

目前，肿瘤已经成为威胁人类健康的重要疾病，其发病率逐年上升，但其发生发展的分子机制仍未完全阐明，TGF-β/ Smads 信号转导通路在机体组织中生物学作用广泛,与肿瘤的发生发展密切相关。因此，本实验利用DNA重组技术将Smad2/3/4重组到pcDNA3.1myc-HisA载体中，通过酶切和测序保证扩增片段的正确性，并采用Western blotting方法证实融合蛋白的表达。融合蛋白中含有myc标签，可用于目标蛋白的纯化和检测。

综上所述，本实验成功构建pcDNA3.1myc-HisA- Smad2/3/4真核表达质粒，为进一步研究其在信号转导通路中的作用提供了实验基础。

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