重症监护病房耐甲氧西林金黄色葡萄球菌同源性分析

房杰 孙兰菊 宗春辉 马量 邱奇 吴尚为

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是引起医院内感染的重要病原菌，而重症监护病房(ICU)是医院内感染MRSA的高发区。我院ICU由于重视对MRSA的预防和控制，MRSA的分离率很低，2007年仅分离出MRSA 4例，但2008年3月近1周就分离出MRSA 3例，并且耐药表型相似，因此利用脉冲场凝胶电泳对菌株同源性进行了回顾性研究，以便为医院感染控制提供准确的实验数据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 3株金黄色葡萄球菌(剔除重复菌株)分离自该院2008年3月ICU患者的痰标本，感染MRSA的3例患者均使用了呼吸机，并出现了肺感染，患者的一般情况见表1。

表1 ICU感染MRSA患者的一般情况

1.2 试剂与仪器 MH培养基购自天津金章新技术研究所，药敏纸片购自英国Oxoide公司;葡萄球菌溶菌素(lysostaphin)为Sigma产品;溶菌酶，蛋白酶K购自QUAGEN，限制性内切酶SmaI为Takara公司产品;低熔点琼脂糖，PFGE电泳专用琼脂糖均为BioRad公司产品;Ladder购于New England;漩涡混合器购自上海精科实业有限公司;台式离心机为SANYO公司产品;蛋白核酸测定仪购自Eppendorf AG公司，凝胶成像系统为BIO-RAD公司的Gel Doe凝胶成像系统。Bio-Rad CHEF MAPPERTM型电泳仪购于BioRad公司。

1.3 药物敏感性试验 采用K-B法测定金黄色葡萄球菌对17种抗菌药物青霉素、氨苄西林、苯唑西林、头孢西丁、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、红霉素、克拉霉素、克林霉素、四环素、利福平、喹奴普汀/达福普汀、利奈唑胺、万古霉素及替考拉宁的敏感性。以金黄色葡萄球菌ATCC 25923为药敏质控菌株，结果按2007年CLSI规定判读。

1.4 脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型

1.4.1 样本制备:挑取在TSA固体培养基上过夜培养的MRSA 2～3个菌落于5 ml TSB液体中37℃水浴摇床过夜培养。取500 μl菌液13 000 r/min离心2 min。弃上清加500 μl PIV，漩涡混合器混匀，13 000 r/min离心2 min，弃上清加200 μl PIV漩涡混合器混匀。用蛋白核酸测定仪OD620测光密度，1 000 μl PIV调零后将 5 μl菌液加入 1 000 μl PIV 中测定样本菌含量(0.05～0.15)读数用计算公式(40×OD600×210)-210计算出所需PIV量依次加入1.5 ml离心管。取150 μl菌液42℃ 10 min，1.5%低熔点胶42℃水浴，并将两者1∶1混匀。取20 μl滴到载玻片上放好盖玻片，-20℃ 5 min室温10 min。

1.4.2 溶菌:1 ml Eclysis 37℃水浴3 h，吸出 Eclysis加1 ml ESP 50℃水浴至少17 h，13 ml TE摇床摇30 min，连续5次。

1.4.3 酶切:20 U SmaI过夜酶切，10×LB 5.5 μl终止反应。

1.4.4 跑胶:PFGE电泳专用琼脂糖制胶。在CHEF Mapper XA system脉冲场电泳仪中电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，条件为电压6 V/cm、角度60/-60、脉冲时间5 s、温度14℃、时间23 h，用 Ladder作为分子量标准。

1.4.5 PFGE结果判读:用EB染色后用Gel Doe凝胶成像系统扫描成像。PFGE图谱结果判断标准［1］:酶切后DNA条带相差3条以内为同一克隆。

2 结果

2.1 药敏结果 3株MRSA耐药谱基本一致。3株菌株仅对万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺，喹奴普汀/达福普汀、复方新诺明敏感，对青霉素、氨苄西林、苯唑西林、头孢西丁、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、红霉素、克拉霉素、克林霉素、四环素、利福平显示出耐药。

2.2 3株MRSA脉冲场凝胶电泳分型 PFGE结果显示这3株菌株酶切条带完全一致，是同一克隆株。见图1。

3 讨论

图13 株MRSA的PFGE图谱

MRSA是引起医院内感染的重要病原菌，ICU的患者由于患者病情危重，生理防御功能衰退，使用呼吸机、动静脉插管等侵入性操作繁多，破坏了人体的自然免疫力，为MRSA的侵入提供了条件。该研究中的3例患者由于年老体弱，患有严重的基础病，并且又进行了气管切开术，使用了呼吸机，存在严重的肺感染。多次痰培养均为混合菌感染。除MRSA外，还分离出肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌等，所以使用了大量的广谱抗生素，如亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦。当分离出MRSA后，又分别使用了万古霉素或利奈唑胺。经过治疗1号患者转入呼吸科病房，后痊愈出院。2号患者死于肺感染。3号患者肺部感染得到控制后，家属要求自动出院。调查显示，呼吸机可能是造成此次MRSA暴发流行的主要途径之一，患者的年老多病及广谱抗生素的使用为MRSA的侵入提供了条件。

当出现3例耐药谱相似的多重耐药的MRSA后，细菌室及时反馈给感染科。感染科立即与ICU病房采取了相应的控制措施:严格管理制度;严格手部卫生;加强空气与物品的消毒;加强医疗器械的消毒与处理;按照细菌体外药敏结果，调整抗生素的使用等。结果在4、5月份均未分离出MRSA。可见为控制MRSA交叉感染，严格无菌操作、加强消毒隔离措施，合理使用抗生素非常重要［2，3］。同时微生物室耐药菌监测报告也是防控MRSA在院内流行的措施之一［4］。

PFGE是建立在限制性内切酶多态性分析基础上的分型技术，具有分辨率高、费用相对较低等特点，常用于短时间、小范围的流行病学调查。是当前国际上医院感染爆发流行的诊断金标准，是追查病原菌传染源和传播途径的有效方法。

1 Afzal-shah M，Woodford N，Livermore DM.Characterization of OXA-25，OXA-26，and OXA-27，molecular class D betalactamse associated with carbapenem resistance in clinical isolates of acinetobacter baumannii.Antimicrob agents chemother，2001，45:583-588.

2 孙宏莉，王辉，陈民钧.甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌耐药性及分子流行病学调查.中华微生物学和免疫学杂志，2005，25:137-141.

3 陈红岩，唐玉分，孙嫣.重症监护病房耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的预防与控制.中华医院感染学杂志，2009，19:2987-2988.

4 王靖，赵应兰，杨爱芝.对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌医院感染的管理.中华医院感染学杂志，2010，20:297.