氯化汞对小鼠Lewis肺癌细胞的增殖抑制作用

李 丹，荆 蕾，丁 会

（吉林大学白求恩第一医院 呼吸内科，吉林 长春130021）

非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌发生率的3／4，手术是Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC患者的最佳治疗手段。但在我国，大多数NSCLC就诊时已是中晚期，同时，Ohta等于2006年报道［1］，肿瘤直径≥5cm的Ib期NSCLC完全切除后的中位无病生存期仅为9个月，术后1年的复发率高达56．8%，提示根治术后有必要进行辅助化疗。因此，内科治疗仍是肺癌的主要治疗方法。但近十年来，以铂类化疗为主的治疗手段并未使NSCLC的疗效获得突破性进展，20世纪90年代以来分子靶向治疗虽然疗效卓越［2］，但由于受基因型及昂贵费用的限制，也无法得到广泛的推广。本课题组拟在发现有机汞具有多途径抗癌效应的基础上［3］，进一步探讨无机汞对小鼠Lewis肺癌细胞的增殖抑制作用，以期为NSCLC治疗开辟新的治疗途径提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 体外实验

1．1．1 材料 小鼠Lewis肺癌细胞系由王晓军博士赠送，本实验室冻存。氯化汞（MC）为国产分析纯试剂，FACSAN流式细胞仪（Flowcytometry，FCM）由美国BD公司生产。

1．1．2 细胞培养 小鼠Lewis肺癌细胞复苏后以含10%小牛血清、100U／ml青霉素，100U／ml链霉素的DMEM培养液（高糖）于37℃，5%CO2和100%饱和湿度培养，用0．25%胰酶消化，每3～4d换液传代1次。

1．1．3 细胞增殖抑制实验 采用 MTT比色法。实验分组：对照组、氯化汞组。取对数生长期的小鼠Lewis肺癌细胞，以2×105／ml接种于96孔培养板，每孔190μl，培养12h，待细胞完全贴壁后弃去培养液，分别加入终浓度为40、20、10、5、2．5pmol／L的氯化汞（10μl／孔）。每组设5个复孔，同时设空白（仅加培养液）对照组。加药后送回培养箱中继续培养，分别于24、48、72h后，每孔加入20ulMTT液（5mg／ml），4h后，1 000r／min离心5min，弃上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μl，振荡10 min，使 MTT还原产物完全溶解，DG－3022A型酶联免疫检测仪测定每孔光密度（A）值，波长定于570 am，计算增殖抑制率。

细胞增殖抑制率（%）＝（1－实验组平均吸光度值／对照组平均吸光度值）×10%。

1．1．4 小鼠Lewis肺癌细胞生长密度及形态变化

将接触氯化汞不同浓度、不同时间的各组细胞置于倒置显微镜下，观察细胞生长密度及形态变化，并摄片，放大倍数为100倍。

1．1．5 统计学处理 采用多因素有重复数据的方差分析（Mutiple ANOVA）及Tukey两两比较方法。

1．2 体内实验

1．2．1 实体瘤模型的制备 将2×106个Lewis细胞注射于C57BL／6纯系小鼠（6－8周龄，18－22g，雌雄各半，购自吉林大学实验动物中心）右下肢后外侧皮下，共注射30只，30天后，选出瘤体直径达5 mm的小鼠20只，随机分为对照组（10只）和实验组（10只）。

1．2．2 肿物体积测量及病理组织细胞观察 实验组裸鼠每次灌胃给于10ng／kg MC，隔日1次，共5次；对照组以相同途径给于相同体积的生理盐水。停药后观察1周，全部处死各组小鼠，再测量肿物长短径，肿瘤体积以长径×短径2×0．5236计算［4］。取瘤组织置于10%福尔马林中固定，制备病理组织学切片，HE染色观察组织细胞改变。

1．3 统计学处理

采用SPSSl0．0统计软件包进行数据统计学分析，组间比较应用t检验，P＜0．05视为有统计学意义。

2 结果

2．1 氯化汞对小鼠Lewis肺癌的增殖抑制作用

氯化汞对小鼠Lewis肺癌细胞有较强的增殖抑制作用，A570值与对照组比具有显著性差异，且随着浓度的增加，逐渐变小，说明增殖抑制作用存在着剂量依赖性；48、72h后，A570值下降幅度进一步加大，说明增殖抑制作用存在着时间依赖性。即氯化汞对小鼠Lewis肺癌细胞的增殖抑制作用存在着时间和剂量效应关系，而且同一时间各浓度之间、同一浓度各时间之间均存在显著性差异（P＜0．001），见表1。

表1 MC各浓度组不同时间点A570值和细胞增殖抑制率（n＝3，¯x±s，%）

2．2 倒置光学显微镜下各组小鼠Lewis肺癌细胞生长密度及形态变化

对照组细胞贴壁好，生长密集。氯化汞组随药物浓度的增高，均可见圆形、漂浮于培养液中的细胞逐渐增多，细胞数目逐渐减少。

2．3 体内实验

2．3．1 荷瘤鼠给药后的一般情况和肿瘤体积的变化 小鼠Lewis移植瘤模型给药后活动正常，未见活动迟缓及四肢肌力降低，其活动表现同生理盐水对照组。

2．3．2 荷瘤鼠处死后，剥离瘤体，见肿瘤呈分叶状，被膜大多较完整，少数与局部粘连。结果见MC明显抑制体内Lewis细胞增殖，实验组肿瘤体积与对照组比有统计学意义，见表2。

表2 氯化汞对Lewis肺癌细胞荷瘤鼠肿瘤体积增长的抑制作用（¯x±s）

2．3．3 HE染色形态学观察Lewis肿瘤组织病理学改变 对照组Lewis细胞丰富密集，坏死很少。治疗组Lewis细胞生长密度较对照组降低，细胞数目较对照组减少，坏死增多，并可见到细胞收缩，体积变小，核固缩，蓝色深染的凋亡形态学改变细胞。

3 讨论

肺癌的发病率和死亡率在逐年上升，现已经跃居各种恶性肿瘤的第一位。其中非小细胞肺癌对化疗不敏感，尤其引人重视。自发现顺铂具有抗癌作用以来，NSCLC的治疗有所改观［5］，金属抗癌药物的研究随之引起了人们的广泛兴趣。目前，国内外均有研究证实，氯化汞诱导恶性肿瘤细胞凋亡的能力强于As2O3［6］，对恶性度高、极易全身转移的小细胞肺癌治疗更具合理性。我们在以往研究汞毒性作用基础上，也证实汞制剂具有诱导恶性肿瘤细胞凋亡的能力，且其能力强于As2O3［7］。

本文进一步通过体外实验和体内实验研究了氯化汞对NSCLC细胞及瘤体的增殖抑制作用。结果表明，氯化汞对小鼠Lewis肺癌细胞有较强的增殖抑制作用，且该作用存在着时间和剂量效应关系。动物实验证明，氯化汞在机体内对肿瘤仍然有较明显的增殖抑制作用。氯化汞抑制小鼠Lewis肺癌细胞增殖的机制可能与干扰细胞周期，诱导细胞凋亡有关。另外，本实验应用了人肺癌裸小鼠移植瘤模型来检测氯化汞体内抗肿瘤效应。这种人肿瘤异种移植模型的优点是：肿瘤仍保持其原有的药物敏感性，其化疗反应性与临床病人有较好的相关。通过实验组和对照组治疗前后肿瘤体积测量，结果显示，氯化汞治疗组产生了明显的抑瘤效果（P＜0．01）。同时可见裸鼠活动正常，未见活动迟缓及四肢肌力降低。由此可以初步推断所给剂量及给药方式对裸鼠的毒副作用小。因此，氯化汞对小鼠Lewis肺癌细胞是敏感的，能促进其死亡，抑制其增殖。

［1］Ohta Y，Shimizu Y，Minato H，et al．Results of initial operations in non－small cell lung cancer patients with single－level N2disease［J］．Ann Thorac Surg，2006，81（2）：427．

［2］曲怡梅，廖国清，刘鹏辉．吉非替尼治疗非小细胞肺癌脑转移的临床研究［J］．Modern Oncology，2012，20（4）：735．

［3］丁 会，许力军，李 丹．氯化甲基汞对小细胞肺癌NCI．H446细胞的增殖抑制作用［J］．中国免疫学杂志，2009，25（12）：1085．

［4］Sawaoka H，Tmji S，Tsujii M，et al．Cyclooxygenase inhibitors sup－press angiogenesis and reduce tumor growth in vivo［J］．lab Invest，1999，79（12）：1469．

［5］Ogasawara T，Kasamatsu N，Umezawa H，et al．Retrospective analysis of pemetrexed plus cisplatin chemotherapy for elderly advanced non－small－cell lung cancer［J］．Gan To Kagaku Ryoho，2011，38（11）：1813．

［6］杨惠芬，李明勋，张 鹏．氯化汞、三氧化二砷及阿糖胞苷对K562和 HEL细胞株作用的比较［J］．临床血液学杂志，2003，16（5）：243．

［7］丁 会，孙晓艳，吕晓红．氯化汞对小鼠Lewis肺癌细胞周期的影响［J］．吉林医学，2008，29（23）：2184．