结核分枝杆菌临床分离株分型及耐药性分析

陈春华，刘小琴，王永忠

（江苏省常州市第三人民医院检验科 213001）

结核分枝杆菌临床分离株分型及耐药性分析

陈春华，刘小琴，王永忠

（江苏省常州市第三人民医院检验科 213001）

目的分析结核分枝杆菌临床分离株菌型的鉴定及其对6种抗结核药物的药敏检测结果，为临床制订治疗方案提供依据。方法 采用BacT／Alert 3D系统培养液体培养基，培养阳性标本接种在L－J药敏培养基，进行结核分枝杆菌菌型鉴定，并进行耐药结果分析。结果92株结核分枝杆菌中，人结核分枝杆菌24例，牛结核分枝杆菌68例，分别对其做抗结核药物异烟肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）、链霉素（SM）、左氧氟沙星（LVFX）、丁胺卡那（AMK）的两种药物浓度的药敏试验。人结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌对各种药物耐药率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；低浓度药物的耐药率明显高于高浓度药物耐药率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。6种高浓度抗结核药的耐药率SM＞INH＞EMB＞AMK＞RFP＞LVFX。结论INH、RFP、EMB、SM、LVFX、AMK可作为常规抗结核药物，为临床医师根据常规抗结核药物药敏结果制定更加有效的抗结核治疗方案提供重要的借鉴。

分枝杆菌，结核；微生物敏感性试验；抗结核药

结核病是目前严重威胁人类健康的重大传染病之一，是单病因所致的感染性疾病中死亡率最高的疾病，尤其是耐药结核病的发病率呈上升趋势，严重威胁人类的身体健康，中国是全球结核病的重灾区，结核病发病总人数居全球第二。由于不规范的抗结核治疗导致耐药结核分枝杆菌，尤其是MDR－TB的产生与传播是造成全球结核病严峻形势的主要形势之一，2006年以来XDR－TB的出现使得结核病的防控更加棘手［1－2］。为了选择快速、简便、价格低廉且适合基层实验室分枝杆菌分离培养及其药敏试验的方法，笔者选择了BacT／Alert 3D系统进行液体培养基培养，由于BacT／Alert 3D系统仪器和试剂价格昂贵［3］，分枝杆菌培养法是结核病诊断的金标准［4］。因此阳性标本采用L－J药敏培养基进行试验，成本低，适合基层结核病专科医院大批量的结核培养为临床提供快速、准确的药敏结果，为临床医师能合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 结核分枝杆菌标准株（H37RvATCC27294）作为标准野生株对照。收集本院2011年4～9月92例住院肺结核患者的痰标本，年龄14～79岁，平均年龄35岁，所选病例经临床明确诊断。

1.2 仪器与试剂 采用梅里埃公司的BacT／Alert 3D全自动分枝杆菌检测系统和配套试剂，L－J药敏培养基由无锡博慧斯生物医药科技有限公司提供，萋尼氏染液由珠海贝索生物技术有限公司提供，37℃培养箱由上海一恒科学仪器公司提供。

表1 92株结核分枝杆菌药敏结果［（%）、μg／mL］

1.3 方法

1.3.1 标本前处理 按照《结核病诊断细菌学检验规程》操作［5］，采用NaCl－NaOH法进行标本处理。嘱咐患者咳取呼吸道深部的痰液1～2mL，视痰标本性质加入1～2倍量的NaCl－NaOH消化液，漩涡混匀静止待痰液完全液化后，倒入10mL在离心管以3 000r／min离心25min，倾去上清液，留取沉渣加入0.067mmol／L磷酸盐缓冲液（PBS）1mL混匀备用。

1.3.2 BacT／Alert 3D系统分离培养 用10mL复溶液溶解1瓶抗菌药物干粉，在接种标本前，加0.5mL的抗菌药物添加剂至BacT／Alert 3DMP处理培养瓶中，然后每瓶接种0.1mL经NaCl－NaOH法处理的标本，接种后，培养瓶经扫描确认，放入BacT／Alert 3D全自动分枝杆菌培养仪中，由仪器自动检测。仪器提示阳性后取出涂片经抗酸染色证实为抗酸分枝杆菌后报告阳性，阴性在30d后仪器报告阴性后取出。

1.3.3 菌群鉴定和药敏培养 按照结核病诊断细菌学检验规程进行菌群鉴定［4］。经BacT／Alert 3D系统分离培养阳性的标本分别接种在药敏L－J培养基培养的异烟肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）、链霉素（SM）、左氧氟沙星（LVFX）、丁胺卡那（AMK）6种抗结核药物（绝对浓度法）的培养基的斜面上，结核分枝杆菌标准株（H37RvATCC27294）作为标准野生株对照，另外每个标本接种2支改良罗氏培养基的作为对照，接种1支含5μg／mL噻吩－2－羧酸肼（TCH），1支含500 μg／mL对硝基苯甲酸（PNB），作为菌型鉴定。经37℃恒温培养4周后，观察结果并进行药物敏感性鉴定。TCH和PNB二者均阴性为牛结核分枝杆菌，二者均阳性为非结核分枝杆菌，TCH阳性PNB阴性为人结核分枝杆菌。

1.4 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件进行分析，各种耐药率采用百分率计算，耐药率（%）＝阳性株数／人结核菌株数或牛结核菌株数。耐药率两两比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

选取的100例在BacT／Alert 3D系统结核培养阳性标本接种于药敏L－J培养基分型，其中人结核分枝杆菌24例，牛结核分枝杆菌68例，非结核分枝杆菌8例（本文未讨论）。人结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌对各种药物耐药率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），低浓度药物的耐药率明显高于高浓度药物耐药率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。6种高浓度抗结核药的耐药率SM＞INH＞EMB＞AMK＞RFP＞LVFX，结果见表1。

3 讨 论

本研究结果显示，人结核分枝杆菌24例，牛结核分枝杆菌68例，牛结核分枝杆菌占73.9%（68／92），两种菌型耐同种药物的耐药率作比较，无统计学意义（P＞0.05）。因此，人结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌在选择用药方面无显著性差异。药敏试验的药物浓度采用低浓度和高浓度两种，结果显示，耐低浓度药物的耐药率明显高于耐高浓度药物耐药率，二者比较有统计学意义（P＜0.05）。从高浓度的耐药率来看，SM＞INH＞EMB＞AMK＞RFP＞LVFX，其中SM 最高26.3%（9.1＋17.3），其次是INH 20%（11.5＋9.1），这可能与20世纪80年代中期以来抗结核化疗方案以SM、INH的组合有关［6］。近年来，由于SM的不良反应耐药相对较多，逐渐将EMB替代SM用于结核病患者治疗，所以一线的4种药物耐药率SM＞INH＞EMB＞RFP，二线抗结核药AMK和LVFX也有一定的耐药率，高浓度的AMK和LVFX耐药率为（4.3%～4.6%），因此对一线抗结核药物不良反应较大的结核病患者，可以优先选择AMK和LVFX这两种药物治疗。提示治疗MDR－TB的过程中，需防止XDR－TB的出现，有效降低耐多药率。临床医生可以有效地参考结核分枝杆菌药敏检测结果从而制定更加合理有效的治疗方案。

［1］Banerjee R，Schecter GF，Flood J，et al.Extensively drugresistant tuberculosis:new challenges［J］.Expert Rev Anti Infect Ther，2008，6（5）:713－724.

［2］Gandhi NR，Moll A，Sturm AW，et al.Extensively drugresistant tuberculosis as a cause of death in patients co－infected with tuberculosis and HIV in a rural area of South Africa［J］.Lancet，2006，238（9547）:1554－1556.

［3］沈丽，王易伟，王宇.二种不同方法对结核菌培养和药敏的优势互补［J］.临床肺科杂志，2002，7（2）:13－15.

［4］张羽，卢建平，叶淼.四种结核分枝杆菌检测方法的临床应用评价［J］.中国防痨杂志，2006，28（1）:14－17.

［5］中国防涝协会基础专业委员会.结核病诊断细菌学检验规程［M］.北京:中国教育文化出版社，2006:36－39.

［6］沈秀平，徐瑞兴，吕晶.北京西城区新发肺结核病人起始耐药性监测［J］.中国防痨杂志，1999，21（1）:71－91.

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.028

B

1671－8348（2012）34－3641－02

2012－06－09

2012－08－22）