微小隐孢子虫LAMP检测方法的探索＊

史亚东，董海聚，王荣军，张龙现，宁长申，菅复春

隐孢子虫是一种肠道原生寄生虫，可以引起人和动物的隐孢子虫病。该病的最主要症状是腹泻，已被列为世界最常见的6种腹泻病之一［1］，并被世界卫生组织（WHO）和美国疾病控制中心（CDC）列入新发传染病。隐孢子虫大小一般为5～8μm，常用的检测方法可以分为病原学检测（主要借助显微镜）、免疫学检测和分子生物学检测3类［2］，分子生物学检测因其优势较多而广泛应用。Noto mi等［3］2000年建立了一种快速、简单、灵敏、特异并且低成本的核酸扩增方法——环介导等温扩增法（LA MP），这种新颖的核酸扩增方法可以在短时间内简单地得出检测结果，这种优势使其在病原分子检测领域得到广泛地应用，如应用于病毒、细菌和寄生虫等病原的检测［4－7］。

1 材料与方法

1．1 虫种 本实验室保存的微小隐孢子虫（Cr yptosporidiu m par vu m）、贾第虫（Giar dia sp）、肠阿米巴（Enta moeba sp）、球虫（Ei meria tenell a）和类圆线虫（Str ongyloides sp）5种阳性样品。

1．2 主要试剂和仪器 Bst DNA聚合酶大片段（Bst DNA pol y merase lar ge frag ment）购自 NEB公司，三甲铵乙内酯（Betaine）购自Sig ma公司，Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Mar ker和脱氧核苷三磷酸（d NTP Mixt ure）购自Ta Ka Ra公司，MseI内切酶购自 Fer mentas公司，SYBR Green I（10 000×）购自Solarbio公司，E．Z．N．A．®Stool DNA Kit（粪便DNA提取试剂盒）购自OMEGA公司。电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司，型号HwS24），稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂，型号DYY－5），凝胶成像仪（SYNGENE公司，型号In－Genius L HR）。

1．3 DNA的提取 按照E．Z．N．A．®Stool DNA Kit说明书操作，对保存的不同虫株阳性样品提取DNA，－20℃保存备用。

1．4 引物设计选择及合成 袁忠英等［8］在国内首次报道用LA MP检测牛源隐孢子虫卵囊，其根据微小隐孢子虫18s r RNA基因序列（Gen Bank登录号3873244）设计了4条隐孢子虫特异性引物（F3、B3、FIP、BIP）。根据这4条引物利用Pri mer Explorer V4（htt p：／／pri merexplorer．jp／elamp4．0．0／index．ht ml）设计了2条环引物（LF、LB，序列见表1）。引物由华大基因合成。

表1 微小隐孢子虫LAMP引物序列Tab．1 The sequence of LAMP primers for Cr yptosporidium parvum

1．5 LA MP反应和PCR反应建立 根据文献［3］，设定LA MP反应初始体系组成为：FIP和BIP各1．6μmol／L，F3和 B3各0．2μmol／L，1．4 mmol／L d NTP Mixt ure，0．8 mol／L Betaine，20 mmol／L Tris－HCl（p H 8．8），10 mmol／L KCl，10 mmol／L（NH4）2SO4，8 mmol／L Mg SO4，0．1%Tween20，DNA模板2μL，加双蒸水至25μL。反应混合物先在95℃加热5 min使DNA解链，放在冰上冷却5 min后加8 U Bst DNA聚合酶大片段，然后在65℃孵育1 h，最后在80℃10 min终止反应。分别取5μL扩增产物经1．5%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

根据相关文献［9－10］，选择 LA MP 引物中的 F3和B3作为PCR上下游引物进行扩增，扩增片段大小为193 bp。25μL PCR体系中包括1×PCR Buffer，上下游引物各0．4μmol／L，d NTP Mixt ure 2 mmol／L，Taq DNA 聚合酶0．625 U，2μL模板DNA，加双蒸水至25μL。反应过程为：95℃变性5 min，95℃45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。

1．6 LA MP反应的优化

1．6．1 反应过程、时间、温度的优化 选用同一份微小隐孢子虫阳性样品，做A、B、C 3组扩增反应，每组做3个重复；并用双蒸水做空白对照。其中设置B组和空白对照在水浴锅中95℃反应5 min、65℃反应60 min、80℃终止反应10 min；A组不经过95℃5 min热变性过程，C组不经过80℃10 min终止反应过程，其余反应条件均相同。

设置反应温度分别为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，观察对反应结果的影响，并做阴性对照，阴性对照温度为63℃。

设置反应时间分别为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、100 min，并做阴性对照，阴性对照反应时间为60 min。

1．6．2 反应体系组成的优化 对体系中的Beta－ine、MgSO4、d NTP Mixt ure浓度，酶工作浓度和外内引物比等进行优化。

设置Betaine的终浓度梯度为：0．2 mol／L、0．4 mol／L、0．6 mol／L、0．8 mol／L、1．0 mol／L、1．2 mol／L、1．4 mol／L，阴性对照的终浓度为0．8 mol／L，其他条件相同。

设置 MgSO4的终浓度梯度为：2 mmol／L、4 mmol／L、6 mmol／L、8 mmol／L、10 mmol／L、12 mmol／L、14 mmol／L，阴 性 对 照 的 终 浓 度 为 8 mmol／L，其他条件相同。

设置d NTP Mixture的终浓度梯度为：0．8 mmol／L、1．0 mmol／L、1．2 mmol／L、1．4 mmol／L、1．6 mmol／L、1．8 mmol／L、2．0 mmol／L，阴性对照的终浓度为1．4 mmol／L，其他条件相同。

设置酶的终浓度梯度为：2 U／25μL、4 U／25 μL、6 U／25μL、8 U／25μL、10 U／25μL、12 U／25 μL、14 U／25μL，阴性对照的终浓度8 U／25μL其他条件相同。

L MAP反应中F3和B3引物的浓度对反应结果影响很小［3］，本研究中固定外引物F3和B3的浓度（0．2μmol／L），把内引物FIP和BIP的浓度进行梯度优化，按外内引物比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14进行，阴性对照的外内引物比为1∶8，其他条件相同。

1．6．3 添加环引物对反应的影响 反应体系中添加环引物（LF、LB各0．8μmol／L，25μL体系），设置反应时间分别为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，其他条件不变。

1．7 LA MP特异性试验 分别选用微小隐孢子虫、贾第虫、肠阿米巴、球虫、类圆线虫DNA作为模板进行LA MP反应，并用双蒸水做空白对照，每个体系模板量为2μL，其他条件相同。

1．8 LA MP敏感性试验 对经蔗糖梯度浓集并计数的100万微小隐孢子虫卵囊（100μL，1 000万／m L）提取DNA，把DNA分别稀释为原液的10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6倍（相当于5×102、5×101、5×100、5×10－1、5×10－2、5×10－3个卵囊／μL，原液相当于5×103个卵囊／μL）；用这些梯度DNA样品来检测LA MP方法的敏感性，并和常规PCR方法比较。

1．9 产物酶切试验 对LA MP扩增产物进行MseI酶消化，30μL反应体系成分为：10μL LA MP扩增产物，1μL MseI酶，2μL10×Buffer R（随酶提供），加双蒸水至30μL。65℃孵育10 h。取5μL消化后产物2．0%琼脂糖凝胶电泳（低电压），观察结果。

1．10 LA MP产物的检测方法的比较 本研究选用的LA MP产物检测方法有：1．凝胶电泳；2．可见光下直接观察浊度；3．3 000 r／min离心2 min，观察沉淀；4．添加1μL1000×SYBR Green I显色后直接光观察；5．添加1μL 1000×SYBR Green I显色紫外成像观察。

2 结 果

2．1 反应过程、时间、温度的优化结果 A、B、C3组扩增产物经电泳后，均出现LA MP特征性梯形条带，95℃5 min热变性过程和80℃10 min终止反应过程对扩增反应影响不大，阴性对照无条带，见图1。可见热变性和酶失活这两个过程对实验结果影响不明显。这和Kentar o等［11］报道的用浊度仪检测LA MP扩增热变性和非热变性模板的结果相一致。因此，在检测样品较多、现场临床检测等情况下可以省去这两个过程以节省时间。

最佳反应温度为63℃，见图2。扩增反应在50 min时出现清晰条带，确定最佳反应时间为60 min，见图3。

图1 不同反应过程对LAMP的影响Fig．1 Effect of different reaction process on the LAMP M：DL2000 DNA marker；1－3（A）：65℃for 60 min，80℃for 10 min；4－6（B）：95℃for 5 min，65℃for 60 min，80℃for 10 min；7－9（C）：95℃for 5 min，65℃for 60 min；10：Negative control

2．2 反应体系优化结果 体系中 Mg SO4、d NTP Mixture、酶的最佳浓度分 别 为 8 mmol／L、0．8 mmol／L、8 U／25μL。外内引物最佳比为1∶6，由于外引物对实验结果影响很小［3］，所以实验中固定外引物浓度，对内引物浓度进行优化。Betaine的浓度在1．0 mol／L以下几个浓度均展现了较清晰的条带，也有报道［12］不添加Betaine成功扩增的，但Notomi等［3］报道反应体系中有0．5～1．5 mol／L Beta－ine存在的情况下，Betaine会促进DNA双链解链，同时会使碱基的堆积和非特异性扩增减少，最终提高反应效率。因此，我们选用0．8 mol／L作为Betaine最佳浓度，分别见图4、5、6。

图2 温度对LAMP的影响Fig．2 Effect of temperature on the LAMP M：DL2000 DNA marker；1：60℃；2：61℃；3：62℃；4：63℃；5：64℃；6：65 ℃；7：Negative control，63℃

图3 反应时间对LAMP的影响Fig．3 Effect of reaction time on the LAMP M：DL2000 DNA mar ker；1：20 min；2：30 min；3：40 min；4：50 min；5：60 min；6：70 min；7：80 min；8：90 min；9：100 min；10：Negative control，60 min

图4 Betaine浓度对LAMP的影响Fig．4 Effect of Betaine concentration on the LAMP M：DL2000 DNA Mar ker；1：0．2 mol／L；2：0．4 mol／L；3：0．6 mol／L；4：0．8 mol／L；5：1．0 mol／L；6：1．2 mol／L；7：1．4 mol／L；8：Negative control，0．8 mol／L

2．3 环引物的效果 反应体系中添加环引物后，LA MP出现清晰条带的时间缩短到了20 min，见图7。Naga mine等［13］第一次报道使用环引物来加速LA MP反应过程，使用环引物的LA MP反应时间会比未使用环引物的LA MP反应大大缩短。如此短的反应时间将有利于该方法用于临床快速检测。

图5 酶的浓度对LAMP的影响Fig．5 Effect of the enzyme concentr ation on the LAMP M：2 000 bp DNA mar ker；1：2 U／25μL；2：4 U／25μL；3：6 U／25μL；4：8 U／25μL；5：10 U／25μL；6：12 U／25μL；7：14 U／25μL；8：Negative control，8 U／25μL

图6 外内引物比对LAMP的影响Fig．6 Effect of ratio of outer and inner primer on the LAMP M：2 000 bp DNA mar ker；1：1／2；2：1／4；3：1／6；4：1／8；5：1／10；6：1／12；7：1／14；8：Negative control，1／8

图7 LAMP使用环引物的反应时间Fig．7 The reaction ti me of using loop pri mers on the LAMP M：DL2000 DNA marker；1：10 min；2：20 min；3：30 min；4：40 min；5：50 min；6：60 min；7：70 min；8：80 min；9：90 min

图8 LAMP和PCR的灵敏度试验Fig．8 Detection li mit of LAMP and PCR M：DL2000 DNA marker；1：5×10 3 oocysts／μL；2：5×10 2 oocysts／μL；3：5×10 1 oocysts／μL；4：5×10 0 oocysts／μL；5：5×10－1 oocyst／μL；6：5×10－2 oocyst／μL；7：5×10－3 oocyst／μL；8：Negative control

2．4 敏感性试验结果与分析 从图8中看出使用相同模板，LA MP的检测限度是5×100个卵囊／μL（图8 A），而PCR的检测限度是5×102个卵囊／μL（图8B）。在LA MP的产物中添加染料SYBR Green I也得到了同电泳一样的结果（图8C）。

2．5 特异性试验结果与分析 特异性试验如图9所示，仅微小隐孢子虫出现LAMP特异梯状条带，贾第虫、肠阿米巴、球虫、类圆线虫及双蒸水无特异梯状条带，特异性好。

2．6 酶切后电泳结果与分析 LA MP产物经Mse I酶消化理论上会产生111 bp、65 bp、46 bp 3个片段，在电泳图上100 bp附近及下方出现3个亮带，与预期结果一致，见图10。

图9 LAMP的特异性试验结果M：2 000 bp DNA mar ker；1：微小隐孢子虫；2：贾第虫；3：肠阿米巴；4：球虫；5：类圆线虫；6：双蒸水Fig．9 The result of LAMP specificity test M：2 000 bp DNA mar ker；1：C．par vu m；2：Giar dia sp；3：Entamoeba sp；4：Ei meria tenell a；5：Strongyloides sp；6：Double distilled water

图10 LAMP产物酶切图M：2 000 bp DNA mar ker；1：LA MP产物酶切后Fig．10 Restriction fragments from LAMP products M：2 000 bp DNA mar ker；1：The LA MP pr oducts after restriction digestion

图11 LAMP产物的不同鉴定方法A：直接观察浊度；B：离心后观察沉淀；C：添加染料后直接观察；D：添加染料后紫外成像观察Fig．11 The different methods for accrediting the LAMP products A：Direct obser vation on the t ur bidity；B：Direct observation after centrif uging；C：Direct observation after staining；D：Direct observation by UV after staining．

2．7 LA MP产物的检测方法比较结果

2．7．1 LA MP产物直接电泳，该方法灵敏度高，但需电泳设备，且消耗一定的时间。

2．7．2 可见光下直接观察浊度，阳性和阴性的浊度不易区分，只有当反应产物量大时才易区分，见图11 A。

2．7．3 扩增产物在3 000 r／min离心2 min，观察沉淀，阳性反应管中观察到有白色沉淀附着在反应管底部，而且较清晰；阴性未见，见图11B；

2．7．4 在LA MP反应后在管中添加SYBR Green I显色后直接光观察，看到阳性（亮绿色）和阴性（橙色）对比鲜明，这种显色可以在数秒内完成，见图11C。

2．7．5 LA MP扩增产物添加SYBR Green I显色后紫外成像观察，阳性样品产物呈现了较亮荧光，阴性则较暗，此法需紫外成像仪或紫外灯见图11D。通过这几种检测方法的比较，作者认为凝胶电泳、反应产物离心后观察沉淀和紫外成像更适合实验室检测，而添加染料后直接观察比较适合临床快速检测。

3 讨 论

本研究在前人工作的基础上，设计了环引物，使反应时间大大缩短，建立了快速检测微小隐孢子虫的LA MP检测方法。经过反应体系和反应条件的优化，该方法可以对DNA样品实现20 min内检测，LA MP的检测限度是5×100个卵囊／μL，和Karanis等［14］的报道相一致，但又比Ino mata等［15］报道的RT－LA MP低一些，考虑可能是扩增位点不同及定量方法不同的影响；LA MP检测微小隐孢子虫的灵敏度比常规PCR高100倍，100倍灵敏度的差异和Iseki等［16］报道的一致，但比 Karanis等［14］报道的差异小。凝胶电泳、反应产物离心后观察沉淀和紫外成像观察适合实验室使用，而添加染料直接观察更适合临床或野外条件下判读结果。

LAMP经过近十几年的发展，在分子检测领域发展迅速，它操作简单、结果可直接判断，这些优势使其成为临床疾病快速检测的佼佼者。但也遇到一些问题：该方法灵敏性高容易产生污染，这主要是针对LA MP产物开盖判断结果来说的，适当的指示剂可以解决这个问题，随着研究的深入，一些研究者设计了巧妙的方法改善和提高LAMP方法的实用性。Tao等［17］介绍了一种独特的方法来指示LA MP结果，选用的染料为SYBR Green I，其先将一定量染料加到特制的蜡丸（熔点85℃）内，在反应前把蜡丸放入反应管里，反应过程中蜡丸不会溶解，反应后把反应管加热到85℃，蜡丸溶解，同时染料与扩增产物接触，这样既解决了染料提前加入抑制扩增反应的问题，又解决了反应后开盖加染料容易污染的问题。蜡丸的使用是一个进步，但这样增加了成本且多了一步加热过程，它还有改进的地方，我们可以借鉴使用蜡丸的经验设计更巧妙的方法。Hatano等［18］报道了在一种便携保温袋中进行LA MP扩增，结果非常可靠，这种保温袋可在30 min内从初始温度（环境温度）达到60℃，并可在60℃持续90 min。这种保温袋是一次性使用的，它可以在4℃～37℃的外界温度中稳定工作，如果把它放到一个泡沫塑料盒内，效果更好，而且它们花费较低。其研究中，分别用保温袋和常规加热装置进行LA MP检测，其检测限度差异不明显。这种保温袋不需要电力就可以工作，在一些不发达或电力不充足地区的进行疾病检测非常实用，而且移动性、限时性很强。

LAMP的优势就在于快速、简便，该方法的成功应用受以下几个因素的影响：第一，高效、特异的指示剂对于LA MP的结果判断尤其重要，目前报道的指示剂染料有SYBR Green I、溴化乙锭、钙黄绿素、羟基萘酚蓝等［19－21］，基本上可以满足非凝胶电泳方法的结果判断；第二，影响LA MP结果的关键因子是引物的设计和选择，对于未验证过的病原种类检测，引物应验证后才能使用；第三，DNA的快速提取可为LA MP方法检测的过程节省时间，因此快速、简单的DNA提取方法也是LA MP临床快速检测应用的一个关键因子，目前细菌方面通过加热和离心基本可实现快速、简便地提取DNA。随着相关技术的发展，LA MP在疾病现场快速检测方面将会发挥越来越大的作用。

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