不同SO2添加量的草莓发酵微生物种群及理化特性动态测定

张 丽 娜, 孙 玉 梅, 曹 方, 何 丹

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

草莓属蔷薇科多年生草本植物,营养丰富[1],具有保健功能[2]。草莓酒精发酵过程伴随微生物群落复杂短暂的动态变化[3],这些微生物包括水果表面和酿酒设备中的细菌和酵母菌[4],并不是单一菌属或单一菌株[5]。影响草莓酒发酵过程中微生物种群数量的因素有很多,如草莓品种,果实的部位,生产工艺,初始细胞浓度,温度和SO2等[6]。SO2作为抑菌剂,可选择性地抑制不利于草莓酒精发酵的微生物,保证发酵顺利进行。有学者认为游离SO2通过主动运输或自由扩散的形式被非酿酒酵母菌吸收,通过扰乱其基本的生物途径而起到抑菌作用[7-8]。还有研究认为,酒醪中加入SO2后,酵母菌处于不可培养的状态但仍有活性[9]。但到目前为止,SO2对草莓酒精发酵过程中微生物种群变化的影响尚未见报道。

本工作采用平板涂布培养法研究了不同SO2添加量的酵母强化草莓发酵过程中微生物种群数量的动态变化,测定了草莓发酵醪的还原糖、可溶性固形物、滴定酸、游离SO2和总SO2的含量以及pH等相关参数。

1 实 验

1.1 材料与试剂

草莓,丰香草莓,购于大连果品市场；酵母菌,本实验室筛选自草莓自然发酵醪,经鉴定为裂殖酵母属[10]；果胶酶,酶活力200万U/g,河南洛阳夏盛果汁果胶酶有限公司；亚硫酸,天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 酵母菌种子液的制备

一级种子液:从YEPD斜面上挑取2环酵母菌,接入5 mL 10%的葡萄糖溶液中,于30 ℃静置培养24 h。

二级种子液:将一级种子液接入100 mL的草莓汁中,于30 ℃摇床培养12～16 h,使酵母菌数达到1.5×108～2.0×108cells/mL。

1.3 酵母强化的草莓发酵过程

选择无病斑的草莓,手工去萼,压榨取汁,添加0.05%的果胶酶,45 ℃酶解90 min。取300 mL酶解后的草莓浆装入无菌的500 mL三角瓶中,分别调整浆液中SO2质量浓度为0、60、120、180、240 mg/L。按5%接种量接入酵母菌二级种子液,于25 ℃发酵14 d。

1.4 微生物种群数量测定

1.4.1 培养基

细菌培养采用肉汤培养基,酵母菌采用YEPD培养基,霉菌采用察氏培养基；乳酸菌培养基:蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、K2HPO4·3H2O 0.2%、乙酸钠0.5%、葡萄糖2%、吐温80 0.1%、柠檬酸二钠0.2%、MgSO4·7H2O 0.058%、MnSO4·4H2O 0.025%、琼脂1.8%、pH 6.2～6.4；醋酸菌培养基:葡萄糖1%、酵母膏1%、碳酸钙2%、无水乙醇3%、琼脂1.8%、50 mg/L制霉菌素,pH自然[11]。

1.4.2 微生物种群数量测定

在草莓发酵过程中,定期采集上、下层发酵醪样品,用稀释平板涂布法分别对不同微生物进行培养,定期观测微生物种群数量。

1.5 理化分析

1.5.1 取样方法

在草莓发酵过程中,定期采集均匀的发酵醪样品,分别进行不同理化指标的测定。

1.5.2 测定方法

还原糖测定:采用菲林滴定法[12]；可溶性固形物测定:利用WHT-5型手持糖量折光仪；滴定酸测定:采用酸碱滴定法[12]；pH测定:利用PHS-3C型pH计；酒精度测定:采用蒸馏比重法[12]；游离SO2及总SO2测定:采用直接碘量法[12]。

2 结果与讨论

2.1 酵母强化的草莓发酵醪的微生物种群变化

定期从不同SO2添加量的草莓发酵醪上、下层取样,分别测定酵母菌、细菌和霉菌的数量,结果如图1～3所示。

草莓属温湿性植物,生长环境决定草莓鲜果表面附有大量的酵母菌、细菌和霉菌[13]。由图1～3可见,发酵醪上、下层的酵母菌、细菌、霉菌各自的生长曲线均相似,只是数量有所不同。在发酵初期,发酵醪上层酵母菌和细菌可利用的氧气(醪中溶解氧以及液面上的气态氧)充足,得以快速繁殖,数量较下层多；在发酵后期,液面上的气态氧被较多消耗,上、下层的酵母菌和细菌可利用的氧气量差别不大,表现出数量差别不大。在发酵初期的发酵醪中,营养物质和溶解氧较多,酵母菌和细菌的数量较快增多。发酵4～6 d后,营养物质消耗和代谢产物积累等环境变化使酵母菌进入生长稳定期,细菌的数量逐渐减少。这与李子自然发酵过程的菌群变化相似[6]。草莓发酵醪中的少量霉菌则快速减少直至消失,其中在发酵醪下层比在上层消失提前2天,估计也是可利用氧气量的差别所致。未检测到醋酸菌和乳酸菌。

(a) 上层发酵醪

(b) 下层发酵醪

图1 不同SO2添加量草莓发酵醪中酵母菌数量的变化

Fig.1 Changes of yeast numbers in strawberry fermentation mash with various SO2concentration

(a) 上层发酵醪

(a) 上层发酵醪

以上实验结果说明,在酵母强化发酵的草莓发酵醪中,酵母菌是发酵体系中的优势菌,而细菌和霉菌在多方面竞争力较弱。在发酵醪中添加60 mg/L SO2,对相对好氧的(发酵醪上层)细菌有抑制作用,而对酵母菌和相对厌氧的(发酵醪下层)细菌抑制作用不明显；添加120 mg/L SO2对细菌的抑制作用明显,而对酵母菌生长无抵制作用。

2.2 酵母强化的草莓发酵醪的还原糖质量浓度与可溶性固形物质量分数的变化

可溶性固形物质量分数的变化可反映发酵程度。由图4、5可知,在不同SO2添加量的草莓发酵醪中,可溶性固形物质量分数均呈下降趋势。添加0～120 mg/L SO2的发酵醪中还原糖质量浓度先升高后减少,因为加入的蔗糖在酸性环境下水解,导致还原糖质量浓度升高,而后酵母菌利用了大量糖进行发酵使还原糖质量浓度急剧下降。添加60 mg/L SO2的发酵醪可溶性固形物质量分数下降速度最快,发酵初期还原糖质量浓度上升幅度小,与其他SO2添加量相比,此时酵母菌数量较多,较多利用了还原糖。添加180和240 mg/L SO2时,酵母菌和细菌数量最多,利用了大量还原糖,使还原糖质量浓度无升高趋势。

图4 不同SO2添加量草莓发酵醪中还原糖质量浓度的变化

Fig.4 Changes of reducing sugar in strawberry fermentation mash with various SO2concentration

图5 不同SO2添加量草莓发酵醪中可溶性固形物质量分数的变化

Fig.5 Changes of soluble solid in strawberry fermentation mash with various SO2concentration

2.3 酵母强化的草莓终发酵醪的酒精体积分数

表1显示,草莓发酵醪的酒精体积分数与SO2添加量有关。较高浓度SO2对发酵体系中杂菌有较强的抑制作用,有利于酵母菌成为优势菌并进行酒精发酵。但SO2质量浓度高于120 mg/L 时,因为酵母菌利用发酵醪中的营养物质进行大量繁殖,对酒精发酵有一定的抑制作用,使草莓发酵醪的酒精体积分数较低。

表1 不同SO2添加量的草莓终发酵醪中的酒精体积分数

Tab.1 Ethanol content in strawberry fermentation mash with various SO2concentration

ρ(SO2)/(mg·L-1)φ(酒精)/%ρ(SO2)/(mg·L-1)φ(酒精)/%04.31801.7604.82401.71205.1

2.4 酵母强化的草莓发酵醪的pH与滴定酸质量浓度的变化

如图6、7所示,在发酵过程中,不同SO2添加量的发酵醪pH的变化规律相似,变化幅度均较小。随着SO2添加量增大,发酵醪pH减小,但添加0～60 mg/L SO2对发酵醪pH的影响无显著差别。发酵前2天,不同SO2添加量的发酵醪中滴定酸质量浓度升高,发酵中期,只有添加120 mg/L SO2的发酵醪中滴定酸质量浓度又有升高。与其他SO2添加量的测定结果比,添加180和240 mg/L SO2的发酵醪pH较低,但滴定酸质量浓度也较低,其原因有待于进一步探讨。

图6 不同SO2添加量的草莓发酵醪的pH变化

Fig.6 pH changes of strawberry fermentation mash with various SO2concentration

图7 不同SO2添加量的草莓发酵醪中滴定酸质量浓度的变化

Fig.7 Changes of titratable acid in strawberry fermentation mash with various SO2concentration

2.5 酵母强化的草莓发酵醪的游离SO2与总SO2质量浓度的变化

由图8、9可知,在草莓发酵过程中,发酵醪的总SO2质量浓度始终呈下降趋势；游离SO2质量浓度在发酵的前24 h迅速下降,之后趋于稳定,但添加180和240 mg/L SO2的发酵醪游离SO2质量浓度较高。在酵母菌快速生长期间,会向胞外分泌乙醛,厌氧和低pH有利于酵母菌生成乙醛[7,14],乙醛等羰基化合物能与活性SO2结合形成复合物使游离SO2减少；pH也会影响SO2的电离平衡,pH越低,游离SO2质量浓度越大[15]。综合作用的结果导致总SO2和游离SO2的质量浓度变化。

图8 不同SO2添加量的草莓发酵醪中游离SO2质量浓度变化

Fig.8 Changes of free-SO2in strawberry fermentation mash added various SO2concentration

图9 不同SO2添加量的草莓发酵醪中总SO2质量浓度变化

Fig.9 Changes of total-SO2in strawberry fermentation mash added various SO2concentration

3 结 论

草莓发酵过程是一个复杂的微生物种群变化及生化反应过程,微生物在发酵过程中相互协作、相互制约。添加SO2影响发酵体系中微生物种群的动态变化,进一步引起草莓发酵过程的理化指标改变。添加60 mg/L SO2仅对相对好氧的细菌有抑制作用,添加120 mg/L SO2对细菌的抑制作用明显,添加180和240 mg/L SO2时草莓酒精发酵水平较低。在发酵过程中,添加0～120 mg/L SO2的发酵醪中还原糖质量浓度先升高后减少,添加180和240 mg/L SO2时发酵醪中还原糖质量浓度无变化,不同SO2添加量的发酵醪中可溶性固形物质量分数均呈下降趋势,滴定酸质量浓度和pH变化幅度均较小。

[1] QIN Yonghua, JAIME A, ZHANG Lingxiao, et al. Transgenic strawberry:State of the art for improved traits[J]. Biotechnology Advances, 2008, 26:219-232.

[2] 马子俊,林瑛影,王阳光,等. 草莓酿酒特性和人工加糖发酵工艺的研究[J]. 食品科学, 2003, 24(5):102-106.

[3] CHANPRASARTSUK O, PRAKITCHAIWATTANA C, SANGUANDEEKUL R, et al. Autochthonous yeasts associated with mature pineapple fruits, freshly crushed juice and their ferments; and the chemical changes during natural fermentation[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(19):7500-7509.

[4] NYANGA L K, NOUT M J, GADAGA T H, et al. Yeasts and lactic acid bacteria microbiota from masau (Ziziphusmauritiana) fruits and their fermented fruit pulp in Zimbabwe[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 120(1/2):159-166.

[6] SATORA P, TUSZYNSKI T. Biodiversity of yeasts during plum Wegierka Zwykla spontaneous fermentation[J]. Food Technology and Biotechnology, 2005, 43(3):277-282.

[9] DIVOL B, STREHAIANO P, LONVAUD-FUNEL A. Effectiveness of dimethyl dicarbonate to stop alcoholic fermentation in wine[J]. Food Microbiology, 2005, 22:169-178.

[10] 吕慧威,孙玉梅,芦明春,等. 自选酵母菌株草莓酒发酵特性比较[J]. 食品科学, 2010, 31(11):197-201.

[11] 杜连祥,路福平. 微生物学实用技术[M]. 北京:中国轻工业出版社, 2005:349-355.

[12] 全国食品工业标准化技术委员会. GB/T 15038-1994葡萄酒、果酒通用试验方法[S]. 北京:中国标准出版社, 1994.

[13] 潘见,黄训端,谢慧明,等. 草莓采后卫生微生物学检查及细菌VITEK鉴定实验[J]. 食品科学, 2007, 28(3):320-323.

[14] 魏运平. 葡萄酒酿造中乙醛的形成及其重要作用[J]. 酿酒科技, 2003(2):77-78.

[15] 莫海珍,张浩,李华. SO2及其他环境因子对苹果酸-乳酸细菌的影响[J]. 酿酒科技, 2003(5):70-72.