卷丹与亚洲百合种间杂交花粉管生长的荧光观察

雷家军，吴 超

（沈阳农业大学园艺学院，沈阳 110866）

百合是百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）多年生草本观赏花卉。杂交育种尤其是远缘杂交育种是百合育种的重要手段，近年推出的百合新品种大部分是利用远缘杂交技术育成的[1]。百合种间杂交中不亲和性是一个普遍存在的问题。运用花粉管荧光观察技术能够直接判断高等植物自交与异交过程中花粉管的生长情况，对研究花粉管生长特性及杂交不亲和表达部位具有重要意义。荧光观察法简单方便快速有效，因此国内外学者普遍运用这种方法研究果树、花卉等农作物杂交过程中花粉管生长情况[2-5]。本研究运用荧光显微技术对三倍体卷丹百合与二倍体及四倍体亚洲百合品种种间杂交后花粉萌发和生长情况进行观察，初步判断其正反交的杂交亲和性，为克服百合杂交受精前障碍及充分利用我国原产的适应性极强的特异三倍体卷丹百合资源奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料来自于沈阳农业大学花卉基地，应用野生百合卷丹（Lilium lancifolium Thunb.，2n＝3x＝36）与亚洲百合杂种系品种“多安娜”（Pollyanna，2n＝2x＝24）、“精粹”（Elite，2n＝2x＝24）和“布鲁拉诺”（Brunello，2n＝4x＝48）进行正反交，共6个种间杂交组合：①卷丹×多安娜、②卷丹×精粹、③卷丹×布鲁拉诺、④多安娜×卷丹、⑤精粹×卷丹、⑥布鲁拉诺×卷丹。于授粉后不同时间取母本花柱及子房作为材料，对花粉管的生长情况进行荧光观察。

1.2 方法

在母本开花前1 d去雄套袋，开花当天将新鲜的父本花粉涂抹于柱头上，授粉时间为开花当天上午 7:00～10:00，于授粉后 4、8、24、48、72、96、120 h取花柱和子房放入干净的青霉素小瓶中，每个组合取3～5个，用FAA固定液（70%酒精∶冰乙酸∶甲醛＝18∶1∶1）固定、保存。

观察前将固定液倒掉，用蒸馏水冲洗花柱和子房，加入2 mol·L-1NaOH溶液，放在60℃温箱中软化2 h，倒掉碱液，用蒸馏水冲洗3次，加入用0.1 mol·L-1K2HPO4配制的0.1%苯胺蓝溶液，染色2 h以上。观察时将花柱连同子房取出，用解剖针将花柱和子房纵向剖开平铺于载玻片上压片，用Olympus荧光显微镜观察花粉粒在柱头上萌发、花粉管生长及伸向胚珠的情况，测量授粉后不同时间花粉管长度，并拍照。

2 结果与分析

2.1 卷丹作母本种间杂交授粉后花粉管荧光观察

对卷丹与亚洲百合3个品种杂交授粉后花粉管生长的荧光观察，发现这3个品种的花粉均可以在卷丹的柱头上萌发。授粉后4 h，3个组合中多数花粉粒均已萌发并且花粉管长出一定长度，部分花粉管已伸出柱头乳突组织。其中，卷丹×多安娜和卷丹×布鲁拉诺两个组合的柱头附着及萌发的花粉较多，在荧光显微镜下可以观察到明亮的黄绿色（见图版Ⅰ-A）；卷丹×精粹组合的柱头附着及萌发的花粉相对较少。

授粉后8～24 h，随着时间的延长，柱头上萌发的花粉数量增多，花粉管进入快速生长期，大量花粉管成束状向花柱道中延伸（见图版Ⅰ-B）。其中布鲁拉诺的花粉管生长最快、到达花柱的2/3处（3.62 cm），多安娜次之、花粉管到达花柱1/2处（2.73 cm），精粹最慢、只延伸到达花柱的0.20 cm处。

授粉48 h后，多安娜、布鲁拉诺的花粉管已进入子房，花柱道内精粹的花粉管较少，并且有明显的回折现象；72 h后，布鲁拉诺的花粉管到达子房2/3处（见图版Ⅰ-C）并到达胚珠，精粹的花粉管也进入子房。本试验中，卷丹×多安娜与卷丹×布鲁拉诺组合授粉都能得到一定数量的有胚种子，而卷丹×精粹没能得到有胚种子，这与以上荧光观察的结果一致。

2.2 卷丹作父本种间杂交授粉后花粉管荧光观察

2.2.1 多安娜×卷丹授粉后花粉管在花柱中的生长情况

授粉后4 h，花粉粒萌发很少；8 h花粉管仍缠结在柱头表面；24 h花粉管进入花柱道内但花粉管中出现胼胝质；24～72 h花粉管向下伸长，到达花柱1/3处（1.76 cm），但花柱道内的花粉管较少，越向下花粉管越少，同时出现很多横向生长、末端膨大异常现象，花粉管中多处出现胼胝质；授粉后96～120 h，仅有极少几条花粉管到达花柱基部，胚囊细胞出现胼胝质。两个月后田间杂交结实调查表明，这个杂交组合没有得到有胚种子。

2.2.2 精粹×卷丹授粉后花粉管在花柱中的生长情况

授粉8～24 h才有少量花粉萌发；48～72 h花粉管回折异常现象明显（见图版Ⅰ-D），同时花柱道细胞有胼胝质出现（见图版Ⅰ-E）；96～120 h，多数花粉管到达花柱1/5～1/4处（0.95～1.19 cm），仅极少量花粉管（0～3条）可伸长至花柱基部，到达子房，但没有观察到花粉管到达胚珠。两个月后田间杂交结实调查表明，这个杂交组合也没有得到有胚种子。

2.2.3 布鲁拉诺×卷丹授粉后花粉管在花柱中的生长情况

授粉4～8 h后花粉粒萌发，表现正常；授粉后24 h，花粉管在柱头表面出现明显横向生长异常现象；24～72 h花粉管在花柱道内回折、缠绕（见图版Ⅰ-F）；72～120 h大多花粉管到达花柱1/2处（2.56 cm），少量花粉管进入子房到达胚珠。2个月后得到少量膨大蒴果和有胚种子。

图版Ⅰ 卷丹与亚洲百合种间杂交授粉后花粉管生长荧光观察PlateⅠ Fluorescence observation of pollen tube growth from interspecific hybridization between Lilium lancifolium Thunb.and Asiatic lilies

3 讨论与结论

3.1 卷丹与亚洲百合种间杂交亲和性

三倍体卷丹与亚洲百合二倍体和四倍体品种的正反交试验中，卷丹作母本时杂交亲和性较高，在卷丹×多安娜与卷丹×布鲁拉诺两个组合中得到了膨大的果实和有胚种子，表明卷丹是很好的母本材料。卷丹作父本时，花粉在授粉后4～24 h内虽能萌发形成花粉管，但在48～96 h观察到很多异常横向生长的花粉管，120 h时发现极少有花粉管穿过整个花柱到达子房，杂交亲和性差，未能得到有胚种子。因此，在以卷丹为父本的杂交组合中，应加强对授粉方法的研究，可以试验重复授粉、应用植物生长调节剂等方法促进子房膨大[6-9]，以期得到有胚种子。

3.2 种间杂交的花粉管异常现象

通过观察花粉管的生长状态有助于判断杂交是否亲和。有研究表明，多种植物杂交时花粉管生长均出现异常行为，主要表现在：花粉不能在异种柱头上萌发；花粉虽能萌发，但存在着延迟阻碍，花粉管扭曲盘绕，不能或只有少量进人柱头；花粉管进人柱头后由于花粉管先端或全部沉积胼胝质而停止生长或缠绕、分叉、先端膨大、变小等异常现象导致生长缓慢甚至破裂；花粉管虽正常生长，但由于长度不够而不能达到子房完成受精；花粉管即使达到子房，雌雄配子不能受精形成合子或只有卵核或极核发生单受精[10-15]。本试验对不同百合种间杂交组合花粉管在花柱内生长情况的荧光显微观察发现，花粉基本都能萌发，萌发后花粉管穿过柱头，进入花柱，但不同杂交组合的花粉萌发量和花粉管伸长存在差异，并且存在生长异常的花粉管，主要有4种异常现象：一是花粉管在末端出现膨大；二是花粉管横向生长普遍；三是花粉管出现回折、缠绕；四是花粉管生长过程中出现大量胼胝质，出现的部位有花粉管、花柱道细胞、胚囊。王文和等观察百合远缘杂交时认为，“Bernini”柱头乳突细胞是阻碍“Pollyanna”花粉管生长的第一道屏障，花柱道细胞是抑制花粉管在花柱内生长的第二道屏障[16]；李守丽等观察到大百合与百合属间杂交后花粉萌发与花粉管的伸长速度相对于自交滞后，个别花粉管出现末端分叉、膨大、变细或中间部分折叠，花粉管内胼胝质不规则大量沉积等现象[17]。虽然杂交亲和性与花粉管的行为有关，但杂交的成功与否还受到受精后诸多因素的影响，还需要从胚胎学和遗传学方面进一步探讨。

[1]Jaap M,van Tuyl.Overcoming interspecific crossing barrier in Lilium by ovary and embryo[J].Acta Horticulturae,1990,266:317-322.

[2]睢薇,丁晓东.草原樱桃与欧洲甜樱桃远缘杂交不亲和原因初探[J].东北农业大学学报,1999,30(2):148-153.

[3]马瑞娟,杜平,胡金良,等.桃、李种间远缘杂交亲和性研究[J].果树学报,2005,22(3):283-285.

[4]丘杰,杨必建,江良荣,等.水稻与高粱属间远缘杂交花粉管行为观察[J].分子植物育种,2005,3(6):835-840.

[5]蒋宇,李海涛,刘爱群.中国南瓜和印度南瓜远缘杂交亲和性与生理生化变化的研究[J].东北农业大学学报,2009,40(8):23-27.

[6]栗艳龄,罗凤霞,沈向群,等.植物生长调节物质对百合不同杂交组合花粉管生长的影响[J].沈阳农业大学学报,2008,39(4):404-407.

[7]刘春,穆鼎,明军,等.百合种间杂交受精前障碍的研究[J].园艺学报,2006,33(3):653-656.

[8]罗凤霞,年玉欣,孙晓梅,等.4种授粉方法对切花百合不同杂交组合结籽量的影响[J].园艺学报,2005,32(4):729-731.

[9]王壮伟,赵密珍,钱亚明,等.草莓花粉生活力的测定[J].东北农业大学学报,2010,41(3):48-52.

[10]李辛雷,陈发棣,赵宏波.菊属植物远缘杂交亲和性研究[J].园艺学报,2008,35(2):257-262.

[11]Asano Y.Pollen-tube growth in interspecific crosses of Lilium longiflorm Thunb.(Ⅱ)[J].Journal of the Japanese Society for Horticultural Science,1981,50(3):350-354.

[12]Amaki W,Higuchi H.Effects of stylar exudates collected from pollinated pistils on pollen tube growth in Lilium longiflorum[J].Scientia Horticulturae,1991,46:147-154.

[13]Chi H S.Interspecific cross of lily by vitro pollinated ovules[J].Botanical Bulletin of Academia Sinica,2000,41:143-149.

[14]Kim H J,Nijmi Y.Effect of floral age at the time of self-pollination on seed production in several Lilium species[J].Journal of the Korean Society for Horticultural Science,2002,43:16-20.

[15]蔡明,孟锐,潘会堂,等.紫薇属与散沫花属远缘杂交亲和性的研究[J].园艺学报,2010,37(4):637-642.

[16]王文和,王树栋,赵祥云,等.百合远缘杂交花粉萌发及花粉管生长过程观察[J].西北植物学报,2007,7(9):1790-1794.

[17]李守丽,石雷,张金政.大百合与百合属间授粉后花粉管生长发育的观察[J].园艺学报,2006,33(6):1259-1262.