反相高效液相色谱法测定小儿金翘颗粒中绿原酸的含量

杨丽波，黄 丽，杜 宏，杨永寿

（大理学院药学与化学学院，云南大理 671000）

小儿金翘颗粒收载于《国家药品标准：中药新药转正标准》中（ WS3-893（ Z-178）-2004（ Z）），由金银花、连翘、葛根、大青叶、山豆根、柴胡、甘草七味中药组成，具疏风清热，解毒利咽，消肿止痛〔1〕，治疗急性扁桃体炎的功效〔2〕。绿原酸是金银花的主要有效成分，有广谱抗菌，抗病毒，抗肿瘤等多种药理作用〔3-4〕，现行检验标准中只有对小儿金翘颗粒中葛根素、苦参碱、甘草的鉴别方法，为了更有效地控制该药品的质量，保证其疗效，本文采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法对小儿金翘颗粒中绿原酸的含量进行测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；SK 5200H型超声仪（上海科导超声仪有限公司）；AL204-IC型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.2 试药 绿原酸对照品（中国药品生物制品检验所，批号：110753-200413）；小儿金翘颗粒（四川川西制药股份有限公司，批号：20100106、20100103、20100704、20110402）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Agilent XBP-C18柱（4.6×250 mm，5 μm）； 流动相为乙腈-0.4磷酸溶液（ 12∶88）；流速1.0 mL/min；检测波长327 nm〔5-6〕；柱温：25℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

图1 高效液相色谱图

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的绿原酸对照品5 mg，置10 mL棕色量瓶中加50%（V/V）甲醇溶解，定容，摇匀，即得浓度为0.5 mg/mL的对照品溶液。精密移取上述溶液0.5 mL于10 mL棕色量瓶中，加50%（V/V）的甲醇定容、摇匀，即得浓度为0.025 mg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取本品0.4 g，置具塞三角瓶中，精密加入50%（V/V）甲醇20 mL，称定质量，超声处理50 min，冷却至室温，再称定质量，用50%（V/V）甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 除去处方中的金银花，按供试品溶液制备方法，制备阴性对照溶液。

2.3 提取溶剂浓度的考察 精密称取本品0.4 g，共7份，置具塞三角瓶中，各组分别加入20、40、50、60、70、80、100%（ V/V）的甲醇溶液20 mL，按“ 2.2.2”项处理，按“2.1”项色谱条件测定其峰面积并计算绿原酸的含量，结果表明用50%（V/V）的甲醇提取时，绿原酸的含量最高。

2.4 提取溶剂用量的考察 精密称取本品0.4 g，共5份，置具塞三角瓶中，各分别加入50%（V/V）甲醇10、20、30、40、50 mL作为提取剂，按“ 2.2.2”项处理，按“2.1”项色谱条件测定其峰面积并计算绿原酸的含量，结果表明加入甲醇20 mL时样品溶液中的绿原酸即可提取完全。

2.5 样品提取时间的考察 精密称取样品0.4 g，共6份，分别加入50%（ V/V）甲醇20 mL，超声处理10、20、30、40、50、60 min，制备方法同“ 2.2.2”，按“ 2.1”项色谱条件测定其峰面积并计算绿原酸的含量，结果表明超声提取50 min时样品溶液中的绿原酸溶解最完全。

2.6 线性关系考察 分别精密移取“2.2”项配制的浓度为0.025 mg/mL的对照品溶液2、20 μL， 再分别移取浓度为0.5 mg/mL的对照品溶液2、5、10 μL进样，按“2.1”项色谱条件测定峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标作图，得回归方程Y=1664X+1.806（ r=1.0），结果表明绿原酸进样量在0.05～5.00 μg/mL之间有良好的线性关系。

2.7 精密度试验 精密吸取已配置好的绿原酸对照品溶液进样测定，连续重复测定5次，记录峰面积，RSD为0.71%，结果表明精密度良好。

2.8 重复性试验 精密称取样品0.4g，置具塞锥形瓶中，按“ 2.2.2”项处理，按“ 2.1”项色谱条件测定峰面积并计算绿原酸的含量，连续重复测定5次，RSD为0.75%，结果表明本法重复性良好。

2.9 稳定性试验 精密称取本品0.4 g，按“2.2.2”项处理，“2.1” 项色谱条件测定0、2、4、6、8、10、12 h后的峰面积，结果绿原酸含量的RSD为0.51%，表明样品溶液在12 h内稳定。

2.10 加样回收率试验 精密称定已知含量的同一批号供试品0.3 g，共6份，各加入0.5 mg/mL的绿原酸对照品溶液3 mL，再加入50%（V/V）的甲醇17 mL，按供试品溶液的制备项下处理，并按“2.1”项色谱条件测定峰面积，结果表明，本法回收率好。见表1。

表1 加样回收率试验

2.11 样品含量测定结果 精密称取3个不同批号的样品0.4 g，按“ 2.2.2”项处理，按“ 2.1”项色谱条件进行测定，并计算样品中绿原酸的含量。结果批号为20110402、20100704、20100103的样品中绿原酸的含量分别为15.99、14.60、14.21 mg/g。

3 讨论

本实验分别对提取溶剂甲醇的浓度、用量及提取时间进行了考察，结果表明用20 mL50%（V/V）的甲醇提取50 min时，样品溶液中的绿原酸即可提取完全。在3个不同批号的样品中，绿原酸的含量存在一定差异，这可能与生产过程中原料的来源不同有关〔7〕，为了更好地控制药品的质量，保证其疗效，建议药厂建设原料药材的GAP基地。本实验采用高效液相色谱法测定绿原酸的含量，该方法操作简便，快速，重现性好，可作为小儿金翘颗粒中绿原酸的含量测定。

〔1〕国家药典委员会.国家药品标准：新药转正标准（第66册）〔S〕.北京：化学工业出版社，2008：46-49.

〔2〕杨学峰，邓星梅.小儿金翘颗粒治疗急性扁桃体炎疗效观察〔J〕.医学理论与实践，2009，22（ 3）：278.

〔3〕马烽，朱亚玲，陈明辉.金银花中绿原酸提取工艺研究进展〔J〕.食品研究与开发，2011，31（ 7）：164-166.

〔4〕林丽美，刘菊研，王燕，等.RP-HPLC法测定金银花中绿原酸的含量〔J〕.中国实验方剂学杂志，2009，15（ 9）：22-23.

〔5〕王永斌，贾忠，王兴刚，等.高效液相色谱法测定护肝颗粒中绿原酸的含量〔J〕.中国医院药学杂，2011，31（ 2）：164-166.

〔6〕迟芳振，刘婷.高效液相色谱法测定抗感颗粒中绿原酸的含量〔J〕.医药导报，2011，30（ 4）：512-513.

〔7〕胡生俊，徐岳鑫，董赛文，等.高效液相色谱法测定复方金银花颗粒中绿原酸含量〔J〕.药物鉴定，2011，20（ 3）：23.