鹿茸水提物模拟胃肠消化物对小鼠脾细胞增殖的影响

赵 磊，籍保平，王成涛

（1.北京工商大学食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京100048；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

鹿茸水提物模拟胃肠消化物对小鼠脾细胞增殖的影响

赵 磊1，籍保平2，*，王成涛1

（1.北京工商大学食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京100048；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

研究鹿茸水提取物模拟胃肠消化物（AEVA-SGD）的分离组分对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。AEVA-SGD的分离采用凝胶层析法和RP-HPLC法。应用WST-8法检测各分离组分对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，采用高分辨质谱对有效分离组分进行初步鉴定。结果显示，AEVA-SGD经Sephadex LH-20分离后得到6个组分（A～F）。其中，组分F对小鼠脾细胞增殖的影响最为显著，可单独促进小鼠脾细胞增殖，但对ConA诱导的T淋巴细胞增殖有抑制作用。经RPHPLC将组分F分为3个部分，初步鉴定组分F1为鸟嘌呤，F2为1-甲基鸟嘌呤和黄嘌呤，F3为多种小肽的混合物。组分F3对小鼠脾细胞增殖的影响最大，组分F对小鼠脾细胞增殖的影响是其各分离组分协同作用的结果。

鹿茸水提取物，模拟胃肠消化物，分离，小鼠脾细胞，免疫

Abstract：The aim of the present study was to investigate the effect of fractions from simulated gastrointestinal digest of aqueous extract of velvet antler（AEVA-SGD） on murine splenocytes proliferation.AEVA-SGD was fractionated by gel chromatography and RP-HPLC consecutively.The effect of each fraction on the proliferation of murine splenocytes was detected by WST-8.The effective fractions were preliminary identified by high resolution mass spectrometry.The results showed that AEVA-SGD was separated into six fractions（A～F） by Sephadex LH-20.Fraction F（Fr.F） stimulated the proliferation of resting murine splenocytes，whereas inhibited the proliferation of ConA-stimulated murine splenocytes.The effect of Fr.F on the proliferation of murine splenocytes was more effective than the other fractions.After separation by RP-HPLC，Fr.F was fractionated into three parts.The main components of each part were preliminary identified as：guanine（Fr.F1），1-methylguanine and xanthine（Fr.F2），a mixture of small peptides（Fr.F3）.Compared with Fr.F1 and Fr.F2，the effect of Fr.F3 on the proliferation of murine splenocyte was more effective.The total effect of Fr.F on the proliferation of murine splenocyte was due to the synergistic effects of its fractions.

Key words：aqueous extract of velvet antler；simulated gastrointestinal digest；separation；murine splenocyte；immunity

鹿茸为鹿科动物的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，与人参、灵芝、冬虫夏草和阿胶并称为中华养生五大圣品。鹿茸具有生精补髓、养血益阳、强筋健骨、延年益寿等功效，常用于功能性食品和保健品。鹿茸水提取物是鹿茸最为广泛的食用形式之一[1-2]。现代研究证实，鹿茸水提取物具有强壮机体、抗疲劳、免疫调节、促进创伤愈合、抗衰老和抗氧化等作用[3-8]。随着人们的生活水平和健康意识不断提高，亚健康状态引起人们的关注，其最本质的问题是人体自身免疫功能失调。通过免疫调节改善自身免疫状况，是人们远离亚健康的最理想方法。因此，以鹿茸水提取物的免疫调节作用作为研究的切入点具有重要意义。金光湖等[9]报道鹿茸水提取物可增强迟发性免疫反应，增加脾细胞中玫瑰花结细胞的数量，并显著提高绵羊红细胞的凝集素值和溶血素值，从而促进机体的细胞免疫和体液免疫功能。然而，Kim等[10]报道鹿茸水提取物体外能够抑制抗原刺激的T细胞活化，并在高浓度下降低巨噬细胞的吞噬作用，具有免疫抑制作用。可见，鹿茸水提取物对免疫系统可能具有双向调节作用，但具体何种成分发挥作用尚缺乏系统研究。为探讨鹿茸水提取物食用后经胃肠消化降解成何种成分发挥其免疫调节作用，前期研究通过体外模拟胃肠消化模型，探讨鹿茸水提取物在消化过程中免疫调节活性的变化。结果显示，经模拟胃肠消化，鹿茸水提取物对未经丝裂原诱导的小鼠脾细胞增殖的促进作用消失，对ConA诱导的小鼠脾T淋巴细胞增殖的抑制作用增强[5，11]，但具体原因以及活性成分还有待进一步阐明。本研究在前期研究的基础上，采用凝胶层析和RP-HPLC法将鹿茸水提取物模拟胃肠消化物进行分离，评价各分离组分对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响，并对有效分离组分进行了初步鉴定，旨在探讨其免疫调节活性及功能成分，为进一步的开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马鹿茸冻干超微粉 由东北大兴安岭区科技局提供；SPF级Balb/c小鼠（合格证号：SCXK-（军）2007-004），6～8周龄，雄性 购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心；胃蛋白酶、胰酶、刀豆蛋白A（ConA） 购自美国Sigma化学公司；Sephadex LH-20 购自安玛西亚生物科技有限公司；乙腈（色谱纯） 购自美国Fisher公司；甲酸（色谱纯）和三氟乙酸 购自北京化学试剂公司；RPMI-1640高糖培养基、青链霉素混合液、红细胞裂解液、台盼兰、Hepes和CCK-8试剂盒 均购自碧云天生物技术研究所；胎牛血清 购自杭州四季青生物工程材料有限公司；其他试剂 均为国产分析纯。

DBS-100电脑全自动部分收集器和DHL-A电脑恒流泵 上海沪西分析仪器厂；Cintra 6紫外可见分光光度计 澳大利亚GBC科学仪器有限公司；RE-52旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；LGJ-18冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；XDOS-1B倒置生物显微镜 重庆光电有限公司；SW-CJ-2FD双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；MCO-20AIC二氧化碳培养箱 日本SANYO公司；Multiskan MK3自动酶标仪 美国Thermo公司；TGL-20M高速台式冷冻离心机 湘仪离心机厂；MLS2420/2420U全自动杀菌釜 日本SANYO公司；SHIMADZU LC-10A高效液相色谱仪 日本岛津公司；电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪micrOTOF-Q II 德国Bruker公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鹿茸水提取物模拟胃肠消化物（AEVA-SGD）的制备 鹿茸水提取物的制备：称取50g鹿茸超微粉，加入1000mL蒸馏水，沸水浴提取2h，过滤收集提取液，残渣用蒸馏水继续提取2次，每次2h，合并提取液，60℃减压浓缩，冷冻干燥得鹿茸水提取物冻干粉19.3g，经计算水提取物得率为38.5%。

AEVA-SGD的制备：采用文献[6]报道方法制备鹿茸水提取物模拟胃肠消化物。先用胃蛋白酶水解2h，再用胰酶继续水解4h，随后用1mol/L NaOH将pH调至7.0，沸水浴灭酶10min，冷却至室温后，于4℃10000r/min离心20min。冷冻干燥后粉末于4℃保存备用。

1.2.2 AEVA-SGD的凝胶层析分离 称取Sephadex LH-20凝胶干粉加入过量的水，沸水浴浸泡3h，多次浮选去未沉淀细颗粒，洗脱液平衡1h，减压抽气除去气泡。凝胶预处理好后装柱，柱体积为1cm×70cm，凝胶沉积到柱的顶端约5cm处停止装柱，3～5倍体积的洗脱液平衡层析柱。

将AEVA-SGD冻干粉溶于超纯水，浓度为200mg/mL，用吸管将样品滴加到凝胶床面上，上样量1mL，待样品流至床表面，用少量超纯水同样小心清洗表面1次，然后在柱内加满超纯水，链接恒压泵、层析柱、主动收集器，以超纯水洗脱，流速1mL/min，用自动收集器按每管3mL收集洗脱流出液，于254nm波长检测吸光值，合并同一分离峰的洗脱液，冷冻干燥后于4℃储存备用。

1.2.3 AEVA-SGD的高效液相色谱分离 采用RPHPLC技术分离分析经Sephadex LH-20层析柱分离后的活性组分。

色谱条件：ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm，80魡），样品浓度10mg/mL，上样量10μL，流速0.8mL/min，检测波长215nm，柱温30℃，流动相A相：含0.1%TFA的乙腈，B相：含0.1%TFA的水，梯度条件：0～5%A，0～10min；5～50%A，10～30min；50～0%A，30～32min；0%A，32～40min。

1.2.4 小鼠脾细胞悬液的制备 将小鼠（Balb/c）拉颈处死，无菌分离完整脾脏，用PBS冲去浮血，剥除结缔组织及脂肪成分。脾组织剪碎后置于小烧杯上的200目不锈钢滤网上，用注射器针芯研磨，PBS液洗涤，用吸管收集冲洗液至离心管，1200r/min离心5min，弃上清液，加入3mL红细胞裂解液，静置2min，加入10mL PBS终止反应，1200r/min离心5min，弃上清。用PBS液洗两次，不完全RPMI-1640洗一次，加适量RPMI-1640完全培养基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10mmol/L Hepes）重悬细胞。调整浓度至2×106个细胞/mL，台盼兰染色测细胞存活率大于95%。

1.2.5 脾淋巴细胞增殖实验 将上述脾细胞悬液按100μL/孔加入到96孔培养板中，再添加10μL ConA（终浓度为5μg/mL）或不添加ConA 10μL样品溶液，每个处理设6个复孔。同时做正常对照组和ConA对照组，正常对照组为100μL脾细胞悬液，ConA对照组是在100μL细胞悬液中添加10μL ConA（终浓度为5μg/mL）。然后将培养板置于37℃ 5%CO2的培养箱中培养72h。

1.2.6 细胞增殖程度的测定及计算分析 本实验选用CCK-8试剂盒测定细胞增殖程度。结果用刺激指数（Simulation index，SI）表示，公式如下：

1.2.7 AEVA-SGD主要活性成分的液质联用分析HPLC条件：Agilent ZORBAX SB-C18（2.1mm×150mm，5μm）；流速0.3mL/min，检测波长260nm，柱温30℃；流动相A相：0.1%甲酸水溶液，B相：0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脱条件同1.2.3。

micrOTOF-Q II四级杆飞行时间串联质谱仪。电喷雾离子源（ESI）喷射电压为4.5kV；正离子模式；喷雾压力为0.6bar；干燥气（N2）流速为7L/min，温度为180℃；离子扫描范围为20～1000m/z。

1.2.8 统计分析 每个实验重复六次，结果以均值±标准偏差（Mean±SD）表示，采用组间t检验，p＜0.05具有显著性差异，p＜0.01具有极显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 Sephadex LH-20柱分离AEVA-SGD

Sephadex LH-20的分离以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用。如果使用正相溶剂洗脱，则主要靠凝胶过滤作用来分离。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。将AEVA-SGD用Sephadex LH-20凝胶层析进行分离，结果如图1所示。可以看出AEVA-SGD依照分子量大小主要被分成6个主要组分（A～F）。将各段的洗脱液按图中所示收集冷冻干燥后，测定各组分对小鼠脾细胞增殖能力的影响。

图1 鹿茸水提取物模拟胃肠消化物的Sephadex LH-20凝胶层析谱图Fig.1 Gel filtration chromatography of AEVA-SGD on a sephadex LH-20 column

2.2 Sephadex LH-20分离所得组分对小鼠脾细胞增殖的影响

本研究通过各分离组分体外对小鼠脾细胞增殖的影响来评价其免疫调节作用。Sephadex LH-20分离所得组分对未经ConA和经ConA诱导的小鼠脾细胞增殖活性的影响如图2～图3所示。

由图2可知，当浓度≤200μg/mL时，组分A，B，C和E单独对小鼠脾细胞增殖的影响不显著（p＞0.05）。仅在400μg/mL时，组分C才对小鼠脾细胞增殖有抑制作用，而组分E对小鼠脾细胞增殖有促进作用（p＜0.05）。组分D和F在浓度达到1μg/mL时即可促进小鼠脾细胞增殖，随着浓度的升高，SI（不含ConA）值逐渐增大；当浓度达到100μg/mL时，组分D和F的SI（不含ConA）值达到最大，分别为1.089和1.166，浓度继续升高，SI（不含ConA）值开始减小；当浓度升高至400μg/mL时，组分F对小鼠脾细胞增殖表现出抑制作用，其SI（不含ConA）值为0.959，推测其在高浓度时可能具有微弱的细胞毒性，从而对小鼠脾细胞增殖表现为低浓度促进高浓度抑制的剂量效应。

图2 Sephadex LH-20分离所得组分对小鼠脾细胞增殖活性的影响Fig.2 Effect of fractions separated by sephadex LH-20 on the proliferation of murine splenocytes.

ConA是T淋巴细胞的有丝分裂原，可促进T淋巴细胞活化，进而使细胞因子合成、细胞因子受体表达、细胞分化及细胞增殖等变化。机体内T淋巴细胞的数量越大，增殖活性越高，机体由T淋巴细胞介导的细胞免疫功能越强[12]。组分A～F对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖如图3所示。各组分均不同程度的显示出对ConA诱导的脾细胞增殖的抑制作用，其中以组分F的作用最强。在50、400μg/mL时，组分F的SI（ConA）值分别为2.388和1.041，对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖抑制率分别达到了11.9%和61.6%。因此，推测食用鹿茸水提取物可抑制过度的自身免疫反应，帮助人们对抗类风湿等自身免疫疾病，这与鹿茸缓解类风湿性关节炎症状的功能是一致的[10，13]。在400μg/mL时，组分F对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖具有高抑制率，可能与其本身在此浓度时有微弱的细胞毒性有关。绝大多数研究表明，在加入样品的同时加入ConA，样品的免疫调节活性较大。本研究结果显示，AEVA-SGD分离组分与ConA同时加入，淋巴细胞增殖受到强烈抑制。分析原因有：样品本身对T淋巴细胞增殖有抑制作用；样品影响了淋巴细胞对ConA的敏感性或是样品预先与淋巴细胞膜上的ConA受体相结合，使信号转导途径中断，从而抑制了细胞的活化和增殖。具体原因有待进一步探讨，后续实验可采取先加样品再加ConA的顺序进行验证。

图3 Sephadex LH-20分离所得组分对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖的影响Fig.3 Effect of fractions separated by sephadex LH-20 on ConA-stimulated proliferation of murine splenocytes

依据各分离组分对未经ConA和经ConA诱导的小鼠脾细胞增殖实验结果，可知组分F作用效果明显，因此选择组分F（AEVA-SGD-F）用作后续研究。

2.3 RP-HPLC分离AEVA-SGD-F

RP-HPLC利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂（如甲醇、乙腈等）或其水溶液作为流动相，根据物质疏水性的差别进行分离纯化。正常情况下，疏水性弱的物质先被洗脱下来，疏水性强的物质后被洗脱下来。由于RP-HPLC的样品处理量较少，通常将其作为最后一步分离手段。

AEVA-SGD-F通过RP-HPLC分离，将色谱峰分为3个部分，如图4所示。将这3部分分别以F1、F2和F3表示。组分F1极性很强，在C18柱上保留时间很短；组分F2由两个主要的色谱峰组成；组分F3由许多很小的色谱峰组成，且洗脱时所用乙腈浓度较F1和F2高，表明F3相对含有较多的疏水性成分。

图4 AEVA-SGD-F的RP-HPLC图谱Fig.4 RP-HPLC chromatogram of AEVA-SGD-F

2.4 RP-HPLC分离所得组分对小鼠脾细胞增殖的影响

各分离组分对未经ConA诱导和ConA诱导的小鼠脾细胞增殖的影响见图5。由图5（A）可知，在100和200μg/mL时，AEVA-SGD-F各分离组分本身均对小鼠脾细胞增殖无影响（p＞0.05）。我们推测，在100μg/mL时，AEVA-SGD-F本身对小鼠脾细胞增殖的促进作用是其各分离组分协同作用的结果。

图5 RP-HPLC分离所得组分对未经ConA和经ConA诱导的小鼠脾细胞增殖活性的影响Fig.5 Effect of fractions separated by RP-HPLC on the proliferation of murine splenocytes with or without induction of ConA

由图5（B）可知，在100和200μg/mL时，AEVASGD-F各分离组分均可显著抑制ConA诱导的小鼠脾细胞增殖（p＜0.05），尤以高浓度时明显。各分离组分对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖的抑制作用的强弱顺序为：F3＞F2＞F1。低、高浓度的F3对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖抑制率分别达到了49.2%和65.7%。

2.5 AEVA-SGD-F成分的初步鉴定

AEVA-SGD-F成分的HPLC-ESI-HRMS分析见表1。结合已报道鹿茸中存在的成分[14]以及质谱结果，初步鉴定AEVA-SGD-F1的主要成分为鸟嘌呤；AEVA-SGD-F2的主要成分为1-甲基鸟嘌呤和黄嘌呤。AEVA-SGD-F3经HPLC-ESI-HRMS分析检测到20个主峰，分子量在200～600u之间，推测其为多种小肽的混合物。

表1 AEVA-SGD-F主要成分的正离子HRMS分析Table 1 Positive ion HRMS analysis of main compounds in AEVA-SGD-F

3 结论

本研究通过体外模拟胃肠消化模型制备AEVASGD，探讨鹿茸水提取物食用后经胃肠消化降解成何种成分发挥其免疫调节作用。采用凝胶层析和RP-HPLC法将AEVA-SGD进行分离，评价各分离组分对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响，并对有效分离组分进行了初步鉴定。结果表明，经Sephadex LH-20分离后得到一种活性组分F，可单独促进小鼠脾细胞增殖，但对ConA诱导的T淋巴细胞增殖有抑制作用，组分F的各成分间协同作用，初步鉴定为嘌呤和小肽的混合物。本研究提示食用鹿茸水提取物可能抑制过度的自身免疫反应，帮助人们对抗类风湿等自身免疫疾病。

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Effect of simulated gastrointestinal digest of aqueous extract of velvet antler on murine splenocytes proliferation

ZHAO Lei1，JI Bao-ping2，*，WANG Cheng-tao1
（1.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

TS201.4

A

1002-0306（2012）16-0350-05

2012－01－11 *通讯联系人

赵磊（1982-），女，博士，讲师，主要从事功能性食品研究。

北京市教育委员会科技计划面上项目（KM201210011008）。