灵芝多糖对2型糖尿病大鼠心肌组织氧化应激的影响

冯 艳

江苏省南通市第三人民医院药剂科，南通 226006

灵芝（Ganoderma lucidum）在我国自古就有“仙草”的美誉，已有悠久的药用和食用历史，《神农本草经》、《本草纲目》中都有灵芝的药效记载。灵芝是滋补强壮、扶正固本的珍贵药材。研究表明其主要有效成分是灵芝多糖（Ganoderma Polysaccharides，GLPs），具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化和延缓衰老等作用[1]。

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者严重的并发症之一，其临床发生率约为75%。有研究表明，糖尿病心肌纤维化与氧化应激之间关系密切。Brownlee[2]提出的糖尿病并发症统一学说更是引起广泛关注，该学说认为:高血糖引起线粒体中超氧阴离子生成过多，引起多元醇通路的激活、糖基化终末产物的形成、蛋白激酶C（PKC）途径及氨基己糖途径的激活，引起细胞功能紊乱，最终导致糖尿病并发症的发生。因此，氧化应激可与糖基化终末产物（AGEs）相互作用加重纤维化，若能寻求有效的物质来降低机体氧化应激水平，对于糖尿病的心肌组织将具有明显的保护作用。

DCM发病机制尚未明确，近年已有研究提示氧化应激在DCM发生和发展的各个环节中起了重要作用[3-4]。本实验旨在研究GLPs对2型糖尿病（T2DM）大鼠氧化应激的影响，通过检测心脏组织中 NO、SOD、MDA、CAT、GSH-Px的含量变化，以分析其作用是否与抗氧化应激有关，为今后更深入研究GLPs药理作用提供依据。

1 材 料

1.1 药物与试剂

灵芝多糖（江苏安惠生物科技有限公司，批号:110601）；小檗碱（南京白敬宇制药有限责任公司，批号:110501）；链脲佐菌素（streptozotocin,STZ，sigma公司）； 一氧化氮（NO）试剂盒（批号:20110407）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）测试盒（批号:20110411）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）测试盒（批号:20110411）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（批号:20110312）、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒（批号:20110313）均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器

Touch-one血糖仪（美国强生医疗器材有限公司）；BH-NIC-B型倒置显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 动物

SD清洁级大鼠80只，雌雄各半，体重150～180 g，由南通大学实验动物中心提供，动物许可证:FYXK（苏）2007-0021。

2 方 法

2.1 动物模型的建立与分组

将大鼠随机分为正常对照组（N组，10只）和造模组（70只）。造模组大鼠，雌雄各半，给予高能量饮食（饲料配方:脂肪20%、奶粉5%、蛋黄粉5%、基础饲料70%），4周后禁食12h，由腹腔注射STZ 30mg·kg-1（临用前用0.1 mol·L-1的柠檬酸缓冲液配成浓度为1%的STZ溶液）。注射STZ 1周后，测空腹血糖，血糖值≥16.7 mmol·L-1即造模成功，继续高脂饮食。取成模大鼠50只，随机分为5组，每组10只:模型组（DM组）、灵芝多糖低剂量组（GLPs-L组，200mg·kg-1）、灵芝多糖中剂量组（GLPs-M 组，400mg·kg-1）、灵芝多糖高剂量组（GLPs-H 组，800 mg·kg-1）、小檗碱组（Ber组，30 mg·kg-1）。每天灌胃给药 1次，持续12 w。实验期间，各组大鼠均正常喂养，自由饮水。

2.2 各项指标测定

第12 w末，测量大鼠体重，禁食12 h后，经尾静脉取血测空腹血糖，取心肌组织测定NO、SOD、MDA、CAT 及 GSH-Px。心脏组织中 NO、SOD、MDA、CAT、GSH-Px的测定，按试剂盒说明书操作。

2.3 数据处理

3 结 果

3.1 动物一般情况

实验期间，N组大鼠活动自如，外观状态良好，进水、进食量稳定；模型组大鼠毛色无光泽，活动力差，出现多饮、多食现象；GLPs-M组、GLPs-H组和Ber组的大鼠一般情况与模型组相比有明显改善。

3.2 灵芝多糖对T2DM大鼠血糖的影响

12周后，与DM组相比，GLPs-L组经治疗后血糖无明显变化（P＞0.05），GLPs-M 组和 GLPs-H 组血糖浓度较DM组相比均明显下降（P＜0.01），而GLPs-H组血糖显著低于GLPs-M组和Ber组（P＜0.05）。见表1。

表1 灌胃灵芝多糖对T2DM大鼠血糖的影响（n=10）

3.3 灵芝多糖对 T2DM大鼠心肌 NO、SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量的影响

与N组相比，DM组心肌NO水平明显降低（P＜0.01）；与DM组相比，给药后GLPs-L组无明显变化（P＞0.05），GLPs-M 组、GLPs-H 组和 Ber组明显上升（P＜0.01）；与 Ber组相比，GLPs-M 组没有统计学差异（P＞0.05），而GLPs-H组的效果要明显优于GLPs-M 组和 Ber组（P＜0.05）。

DM组心肌MDA含量比N组明显增高（P＜0.01）；与DM组相比，给药后GLPs-L组无明显变化（P＞0.05），而 GLPs-M 组、GLPs-H 组和 Ber组与DM组相比，MDA含量下降显著（P＜0.01）。GLPs-H组与GLPs-M组和Ber组相比，更能降低MDA含量（P＜0.01）。

DM组心肌组织中SOD、GSH-PX、CAT活性与N组比较均明显降低（P＜0.01）；与DM组相比，GLPs-L 组无明显变化（P＞0.05），GLPs-M 组、GLPs-H组和Ber组明显上升（P＜0.05或 P＜0.01）； 其中GLPs-M组和Ber组相比，均无统计学差异（P＞0.05），而 GLPs-H 组 SOD、GSH-PX、CAT 水平高于GLPs-M 组和 Ber组（P＜0.01）。见表 2。

表2 灵芝多糖对T2DM大鼠心肌NO含量、抗氧化酶活性及脂质过氧化物的影响（±s，n=10）

表2 灵芝多糖对T2DM大鼠心肌NO含量、抗氧化酶活性及脂质过氧化物的影响（±s，n=10）

注:与 N 组相比，**P＜0.01；与 DM 组相比，#P＜0.05、##P＜0.01；与 GLPs-M 组和 Ber组相比，△P＜0.05、△△P＜0.01

3.4 灵芝多糖对T2DM大鼠心肌细胞超微结构的影响

如图1所示，N组心肌细胞内肌原纤维清晰，排列整齐，横纹清楚，线粒体串珠样整齐排列于肌原纤维之间，形态大小正常，可见清晰的闰盘；DM组和GLPs-L组心肌细胞内肌原纤维模糊，排列紊乱，断裂严重，横纹不清，线粒体大量增生，分布紊乱，肿胀变形，可见闰盘；GLPs-M组和Ber组较DM组明显好转，心肌胶原纤维排列相对整齐，可见闰盘，线粒体增生以及水肿减轻，但有一定程度的扭曲、断裂；GLPs-H组大部分肌原纤维排列紧密，线粒体增生明显减少，水肿明显好转，排列较整齐，可见闰盘，扭曲断裂程度较GLPs-M组和Ber组减轻。

图1 灵芝多糖对T2DM大鼠心肌细胞超微结构的影响（12000×）

4 讨 论

糖尿病心肌病变是由糖尿病所致的一种心脏疾病，与血管及瓣膜病理改变无关，随着病情的发展逐渐出现心肌收缩力减弱，心肌舒张受限，每搏心输出量显著减少，并出现代偿性的左心室肥厚，最终导致充血性心力衰竭。糖尿病时，机体的高糖环境是糖尿病心肌病发生和发展的始动因素[5]。因此如能有效地降低机体内血糖水平，对DCM的预防和治疗具有重大意义。本实验中发现高剂量GLPs能够有效降低T2DM大鼠血糖水平。已有研究发现，GLPs可能是通过修复T2DM大鼠的胰岛素β细胞，促进胰岛素的释放，从而降低血糖[6]。

Kakkar等[7]学者研究发现，T2DM大鼠的心脏脂质过氧化程度明显增加；Cail等[8]也在2型DM患者的血液和心肌组织中发现有氧化应激标志物的存在。在高糖环境下，机体一方面清除氧自由基的酶（SOD、CAT、GSH-Px）活性降低；另一方面体内的氧化应激作用增强，造成了体内大量活性氧自由基的积聚，导致活性氧连锁反应，从而促进糖尿病心脑血管以及其他一系列并发症的发生和发展[9]。

小檗碱（Berbrine，Ber），又称黄连素，是黄连的主要活性成分。它具有良好的降血糖作用，并且对防治糖尿病心肌并发症也具有一定的疗效[10]。目前已被用于临床治疗或者辅助治疗DM。本实验中，GLPs-M组的疗效与Ber组相当，GLPs-H组各个指标的改善都优于Ber组。

本研究显示，GLPs的中、高剂量可以有效地提高其心肌组织中SOD、CAT、GSH-Px的活性，提高心肌组织中的NO含量，并降低MDA含量，高剂量组的疗效要优于小檗碱组，表明GLPs对于防治DCM的发生发展具有一定的功效，而且GLPs防治DCM机制，除了本身降血糖的作用外，抗氧化应激可能也发挥着重要作用。DCM的发生和发展是受多种因素影响的，比如蛋白激酶C的活化、肾素血管紧张素系统的激活、心肌血管内皮功能的紊乱等，灵芝多糖是否能通过这些途径来预防DCM的发生和发展，还需要更深入、更广泛的研究。

[1]Lin ZB.The pharmacological effects of Ganoderma lucidum[M]//Lin ZB.Contemporary Studies of Ganoderma lucidum∶2nd Ed.Beijing∶Beijing Medical University Press，2001∶219-83.

[2]Boyer JK,Thanigaraj S,Schechtman KB,et al.Prevalence ofventriculardiastolic dysfunction in asymp tomatic，normotensive patients with diabetes mellitus[J].Am J Cardiol,2004,93(7)∶870-5.

[3]Singal PK,Bello Klein A,Farahmand F,et al.Oxidative stress and functional deficit in diabetic cardiomyopathy[J].Adv Exp Med Biol,2001,498(1)∶213-20.

[4]Hamblin M,Friedman DB,Hill S,et al.Alterations in the diabetic myocardialproteome coupled with increased myocardial oxidative stress underlies diabetic cardiomyopathy[J].Mol Cell Cardiol,2007,42(4)∶884-95.

[5]周庆峰，王洪新，王桂君，等.高糖对去甲肾上腺素诱导的心肌细胞肥大的促进作用 [J].中国药理学通报，2003，19（9）:1054-7.

[6]张慧娜，林志彬.灵芝多糖对大鼠胰岛素细胞分泌胰岛素功能的影响 [J].中国临床药理学与治疗学，2003，8（3）:265-8.

[7]Kakkar R,Kalra J,Mantha SV,et al.Lipid peroxidation and activity of antioxidant enzymes in diabetic rats[J].Mol Cell Biochem,1995,151(2)∶113-9.

[8]Cai L,Kang YJ.Oxidative stress and diabetic cardiomyopathy∶a briefreview [J].Cardiovasc Toxicol,2001,1(3)∶181-93.

[9]Johansen JS,Harris AK,Rychly DJ,et al.Oxidative stress and the use of antioxidants in diabetes:Linking basic science to clinical practice[J].Cardiovasc Diabetol,2005,4(1)∶5.

[10]赵洪涛.黄连素对实验性2型糖尿病大鼠心肌SOD活性、MDA含量水平的影响 [J].牡丹江医学院学报，2007，28（3）:9-11.