异甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

汪立平，穆昭艳，张大兵，赵 勇，冷向军

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240）

异甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

汪立平1，穆昭艳1，张大兵2，赵 勇1，冷向军1

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240）

以pET-30（a）为表达载体，将来源于枯草芽孢杆菌K-6（Bacillus subtilis K-6）的异甘露聚糖酶基因（isoman K-6）在Escherichia coli BL21（DE3）中进行了表达。Isoman K-6登录号为HQ902141，基因全长为1083bp，共编码360个氨基酸，工程菌酶活为415.9U/mL，SDS-PAGE电泳表明，工程酶ISOMAN K-6分子量约为45000u，与预期分子量相符。经IDA HisBind树脂柱纯化的纯酶酶学性质研究表明，该重组酶为金属酶，Al3+和Ba2+对其有很强的激活作用，其最适反应温度为55℃、最适pH为6.0，且在pH4.5～7之间有着较好的稳定性，以槐豆胶为底物时，Vmax和Km分别为1.3U/mL和7.3mg/mL。

异甘露聚糖酶，枯草芽孢杆菌，克隆与表达，酶学性质

Abstract：Agene（isoman K-6） encoding an isomannanase of Bacillus subtilis K-6 was cloned using the plasmid vector pET-30（a） and expressed in Escherichia coli BL21（DE3）.Genbank accession number of isoman K-6 was HQ902141，full length of isoman K6 was 1083bp，encoding 360 amino acid residues，activity of recombinant strain was 415.9U/mL.SDS-PAGE demonstrated the molecular mass of recombinant enzyme was 45000u.The isomannanase was purified by IDA HisBind resin column，enzymatic characteristics analysis showed that the enzyme could be activated by Al3+and Ba2+，the optimum temperature was 55℃，the optimum pH for the enzyme was 6.0 and was stable from pH4.5 to 7，The apparent Kmand Vmaxvalues for locust bean gum were 1.3U/mg and 7.3mg/mL，respectively.

Key words：isomannanase；Bacillus subtilis；cloning and eexpression；characterization

甘露聚糖酶是一种半纤维素水解酶，降解产物的非还原末端为甘露糖、甘露寡糖。根据其作用底物不同，甘露聚糖酶可分为β-甘露聚糖酶和异甘露聚糖酶[1]，其中，β-甘露聚糖酶的作用底物为魔芋粉、槐豆胶等植物多糖，这类甘露聚糖是由不同数量的甘露糖、葡萄糖和半乳糖等单糖分子通过β-1，4-D-甘露吡喃糖苷键连接而成的直链或支链聚合糖。异甘露聚糖酶的作用底物为异甘露聚糖，这类甘露聚糖主要存在于酵母等微生物的细胞壁中，为高度分支的多聚体，以α-1，6-D-甘露糖为骨架链，其中大部分甚至全部的残基具有α-1，2-或-1，3-连接的含有2～5个甘露糖残基的侧链。由于甘露聚糖酶的降解产物甘露寡糖可以作为一种新型的饲料添加剂代替高密度、集约化动物养殖中抗生素的使用[2]，所以甘露聚糖酶已成为绿色养殖研究的热点。甘露寡糖的制备方法主要是以甘露聚糖为原料，在酶的作用下水解而成，因此，如何提高酶活制备甘露寡糖成为甘露寡糖产业化有待解决的主要问题。目前，以基因工程技术进行分子育种已被用来改良产甘露聚糖酶微生物菌种，不同来源的甘露聚糖酶基因已被成功克隆并获得具有生物活性的重组酶，如来源于枯草芽孢杆菌[3]、芽孢杆菌[4]、苏云金芽孢杆菌[5]、地衣芽孢杆菌[6]、假密环菌[7]、黑曲霉酶[8]等的甘露聚糖酶基因都被成功克隆与表达，其中马鑫[4]等将来源于芽孢杆菌的甘露聚糖酶基因在大肠杆菌pET-28（a）表达系统进行了表达，所得工程酶的酶活力为4572U/mg，是目前为止较高的。然而迄今为止，人们所表达的工程酶都是以植物多糖为底物的β-甘露聚糖酶，对能水解异甘露聚糖的异甘露聚糖酶的分子育种未见详细报道。异甘露聚糖是广泛存在于微生物细胞壁中的多糖，是制备甘露寡糖极有前景的原料，因此，本研究将对来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis-6的异甘露聚糖酶基因，在大肠杆菌系统中进行表达，并研究其酶学性质，从而为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis-6进行分子育种，构建高产的异甘露聚糖酶的工程菌，最终为高效制备甘露寡糖提供一定的理论和技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株Bacillus subtilis-6 本实验室分离鉴定并保存；克隆质粒PBS-TⅡ、大肠杆菌Escherichia coli TOP10BL21 购自天根公司；表达载体PET-30（a）本实验保存；BamH I、HindⅢ、T4 DNA连接酶及蛋白质低分子量标准 购自宝生生物工程有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、普通质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒、X-Gal、IPTG、Taq PCR Master Mix、1kb DNA Ladder marker等DNA分子量标准 购自天根公司；甲叉双丙稀酰胺、Trisbase、丙稀酰胺、考马斯亮蓝G-250等 购自上海生工公司；琼脂粉、酵母浸膏、蛋白胨等 购自国药集团化学试剂有限公司；酵母细胞壁 实验室自制[9]。

PCR仪 杭州博日科技有限公司；台式高速冷冻离心机 美国Beckman公司；凝胶成像系统、蛋白电泳仪 美国Bio-Rad公司；电热恒温水浴槽、超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；全温振荡培养箱 上海一恒科技有限公司；紫外可见分光光度计UV-2000 上海尤尼柯公司。

1.2 实验方法

1.2.1 异甘露聚糖酶基因的克隆

1.2.1.1 菌株来源及培养 枯草芽孢杆菌K-6是由实验室筛选并保存的能分泌异甘露聚糖酶的菌株，将其以1%的接种量接到LB培养基中，37℃，180r/min培养到对数生长期，备用。

1.2.1.2 总DNA的提取 芽孢杆菌K-6总DNA的提取参照细菌基因组DNA提取试剂盒操作手册进行。

1.2.1.3 引物的设计合成 根据Genebank中枯草芽孢杆菌甘露聚糖酶的基因，利用Primer5.0软件设计特异性引物（在引物中引入适当的限制性酶识别序列）如下：（F）5-CGGGATCCATGCTTAAAAAGTTAGCAG TCTGC-3（BamHⅠ）和（R）5-GCAAGCTTTTATTCCG CGATCGGCGTC-3（HindⅢ），由上海生工公司合成。

1.2.1.4 异甘露聚糖酶基因的克隆 以提取的枯草芽孢杆菌总DNA为模板，25μL PCR（聚合酶链式反应）体系扩增异甘露聚糖酶基因。扩增条件：95℃预变性4min，94℃变性45s，54℃退火30s，72℃延伸合成1min，共30个循环后；72℃最后延伸合成5min。同时以灭菌双蒸水作为阴性对照。将扩增出预期大小的目的基因切胶回收，与PBS-TⅡ载体连接，转入感受态细胞E.coli TOP10中，获得的阳性克隆由上海生工公司代测序。

1.2.2 异甘露聚糖酶基因在大肠肝菌中的表达

1.2.2.1 异甘露聚糖酶基因原核表达载体的构建 依据pET-30（a）表达载体的特点，利用BamH I和HindⅢ作为插入目的基因的酶切位点，对提取的质粒和pET-30（a）进行双酶切后回收酶切产物。将酶切产物连接后转化到感受态细胞Escherichia.coli BL21（DE3）中。加入卡那霉素（Kan）筛选阳性克隆转化子，经测序表明克隆正确，得到重组表达载体pET-M。

1.2.2.2 异甘露聚糖酶的诱导表达 将重组表达载体pET-M转化感受态大肠杆菌宿主菌BL21（DE3）中。获得的阳性菌以1%的接种量接种到含卡那霉素的LB培养基中37℃，180r/min培养至OD600约为0.6时，取1mL菌液做未诱导对照；加终浓度为1mmol/L的IPTG（Isopropyl β-D-1-ThiogalactopYranoside）诱导蛋白的表达，37℃继续培养4～6h，取1mL诱导菌液离心收集菌体，用PBS缓冲液（0.01mol/L的磷酸盐缓冲液）洗两遍后重新悬浮于10mL PBS缓冲液中，超声波破碎菌体后离心，收集上清，沉淀用10mL PBS悬浮，上清和沉淀中分别加入等体积的1×SDS上样缓冲液，煮沸5min，取10μL上12%SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）电泳。

1.2.3 异甘露聚糖酶pET-M的纯化

1.2.3.1 目的蛋白诱导表达条件的优化 将重组菌种子液按1%接种量接入含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养，当OD600约为0.6～0.8时，在以下不同条件下进行诱导表达目的蛋白：采用不同IPTG浓度0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L；不同诱导时间0、1、2、3、4、5、6、7h；不同诱导温度20、25、28、30、32、35、37℃进行表达，分别收集重组蛋白进行SDS-PAGE电泳检测以确定最优表达条件。

1.2.3.2 异甘露聚糖酶的纯化 重组菌按照优化后的表达条件进行大量培养，将培养好的菌液超声波破碎后10000r/min离心10min，收集上清液为表达蛋白粗酶液。蛋白粗酶液经0.45μm滤膜过滤，将4mL过滤好的菌液中加入1mL 50%Ni-NTA His-Bind树脂悬液中，4℃结合60min后，将混合液装入纯化柱中，除去柱下端封闭盖子，先用缓冲液A（50mmol NaH2PO4，pH8.0，300mmol NaCl，20mmol咪唑）洗去非特异性结合蛋白，然后用缓冲液B（50mmol NaH2PO4，pH8.0，300mmol NaCl，250mmol咪唑）洗脱特异性结合蛋白，对收集的溶液进行SDS-PAGE电泳检测。

1.2.3.3 Bradford定量测定蛋白浓度 将纯化后异甘露聚糖酶融合蛋白用Bradford比色法测定蛋白含量。使用的试剂盒由上海生工公司提供。

1.2.3.4 异甘露聚糖酶活力测定 发酵液经10000r/min离心10min，取上清液即为粗酶液[10]。采用DNS法测定酶活力[11]，用0.1mol/L柠檬酸和0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液配制成pH6.5的底物溶液0.5g/L。取底物缓冲液0.9mL预热至60℃，添加0.1mL的粗酶液，60℃反应10min，加入1mL DNS试剂，然后在沸水浴中显色5min，取出冷却后用蒸馏水定容至10mL摇匀，于540nm波长处测定OD值，从标准曲线上查得相应的D-甘露糖含量，计算得出甘露聚糖酶活力。甘露聚糖的定义为：底物每分钟释放出相当于1μmol D-甘露糖的还原糖所需的酶量为1个酶活力单位（U）。

1.2.3.5 异甘露聚糖酶底物专一性的研究 取等量的外购β-甘露聚糖酶和纯化后的异甘露聚糖酶作为酶液，以槐豆胶作为底物，用上述DNS法测定酶活力；取等量的外购β-甘露聚糖酶和纯化后的异甘露聚糖酶作为酶液，以实验室自制的酵母细胞壁作为底物，用上述DNS法测定酶解产物含量。

1.2.4 异甘露聚糖酶酶学性质的研究

1.2.4.1 最适温度和温度稳定性 分别在20～90℃范围内，以0.5%（w/v）的底物浓度测定酶活，得到最适宜酶促反应温度。分别在50、60、70℃保温0～60min，对不同时间和不同温度的样品测定酶活。

1.2.4.2 最适pH和pH稳定性 配制一系列的缓冲液，pH3.0～11.0，将底物溶解于不同pH的缓冲液中，配制成pH不同的0.5g/L的底物溶液，其余按酶活力测定方法测定。将酶液分别加入到不同pH的缓冲液中，在37℃下保温2h后，对不同pH的样品测定酶活。

1.2.4.3 金属离子等对酶活力的影响 分别配制浓度为1mmol/L的以下金属离子化合物，Al3+、Ba2+、Ca2+、Zn2+、K+、Mg2+、Fe3+、Ag+、Cu2+、Mn2+（阴离子均为Cl-），以不含金属离子的酶液为参照，调节pH至6.0，在37℃下保温2h后测酶活。

1.2.4.4 动力学分析 重组异甘露聚糖酶的米氏常数通过测定不同底物浓度[S]下的反应速度V，可以确定酶催化的最大速度Vmax和米氏常数Km。在试管中加入0.1mL酶液，再分别加入0.9mL不同浓度（0.5～20mg/mL）的底物，使总体积为1.0mL。用DNS法分别测定反应后的OD540。1/V为纵坐标，1/[S]为横坐标作图。根据双倒数作图法（Line weaver-Burk），通过横截距和纵截距求出米氏常数Km和Vmax。

2 结果与讨论

2.1 异甘露聚糖酶基因的扩增及序列分析

从枯草芽孢杆菌K-6总DNA中PCR扩增后得到的PCR产物（图1A）的大小约为1100bp，其条带单一，特异性强，与计算出的目的基因片段大小一致。将其割胶回收与PBS-TⅡ载体连接后转入TOP10中，挑取阳性克隆转化子送到上海生工公司进行序列测定。

测定结果表明，该片段全长1083bp，编码360个氨基酸。通过BioEdit软件将目的基因序列翻译成蛋白质序列，并预测其大小约为42000u，加上表达载体上的组氨酸序列约为45000u。经检测发现，该酶的N-端有由氨基酸残基组成的原核表达的信号肽序列，由此可以推断出该酶可以进行分泌表达。重组载体测序结果已提交到GenBank，其登录号为：HQ902141。

图1 异甘露聚糖酶PCR扩增（A）和双酶切鉴定（B）Fig.1 Isomannanase by PCR amplification（A）and restriction enzymes digestion（B）

2.2 异甘露聚糖酶基因表达载体的构建及诱导表达条件优化

将包含重组异甘露聚糖酶蛋白编码基因的质粒用BamH I和HindⅢ双酶切后得到约为1083bp的DNA片段，符合预期结果。双酶切检验如下（图1B）。将载体pET-M在菌株BL21（DE3）中分别诱导表达6h后进行SDS-PAGE电泳分析。结果显示，与对照菌株大肠杆菌相比，在45000u处出现明显表达带（图2：列4）。超声波破碎诱导表达的工程菌，收集上清和沉淀，进行12%SDS-PAGE电泳检测，结果显示，融合蛋白得到了可溶性表达（图2：列4、列5）。

将含重组表达质粒的大肠杆菌37℃培养至OD600约为0.6后，在不同条件下进行诱导表达目的蛋白，结果表明，在所有的诱导条件中，在32℃，IPTG终浓度为0.6mmol/L的条件下诱导4h为最佳诱导条件。

2.3 异甘露聚糖酶的纯化

依据重组蛋白C末端含有6个组氨酸标签，采用镍柱亲和层析进行纯化。经电泳分析显示目的蛋白表达带清晰（分子量约为45000u），与预测目的蛋白大小一致（图2：列8）。通过镍柱亲和层析纯化后得到电泳纯的酶制品，纯化倍数和回收率分别为2.42和39.2（表1）。在预实验得出的最优诱导条件下进行发酵后纯化测酶活，比酶活为543.2U/mg（表1），由其折算为发酵液中可溶性酶活为415.9U/mL，根据方法1.2.3.4测的原始菌株酶活为205.9U/mL，工程菌的酶活比原始菌株的酶活提高了2.02倍。

表1 异甘露聚糖酶纯化表Table 1 Purification of isomannanase from E.coli BL21（DE3）

2.4 底物专一性的研究

槐豆胶是不同单糖分子通过β-1，4-D-糖苷键连接而成的，而酵母甘露聚糖是以α-1，6-D-糖苷键连接的聚合糖。且β-甘露聚糖酶的作用底物为槐豆胶等植物多糖，异甘露聚糖酶的作用底物为异甘露聚糖，主要是存在于酵母细胞壁中的酵母甘露聚糖。由表2得知纯化后的异甘露聚糖酶以槐豆胶为底物时测得的酶解产物含量与外购β-甘露聚糖酶的酶解产物含量相比，其产物含量较低。以酵母细胞壁为底物时，异甘露聚糖酶的酶解产物含量为864.6U/mL，比外购β-甘露聚糖酶的酶解产物含量高5.4倍，结果表明，异甘露聚糖酶的专一性偏重于酵母甘露聚糖。由于很难制备得到纯的酵母甘露聚糖且酵母甘露聚糖在酵母细胞壁中是以糖蛋白的混合物形式存在，作为底物时会有沉淀不适用于分光光度计法，所以在下步的酶学性质研究中使用槐豆胶代替酵母甘露聚糖作为底物。

表2 底物专一性的研究Table 2 The study of substrate specificity

2.5 酶学性质的研究

经IDA HisBind树脂柱纯化的纯酶酶学性质如图3-A所示，重组异甘露聚糖酶的最适温度在55℃，在40～60℃范围内具有相对较高的酶活力。酶的热稳定结果如图3-B所示，分别在50、60和70℃保温0～60min，对不同时间和不同温度的样品测定酶活。由图3-B可知该酶在50℃保温1h后，剩余的相对酶活力为56.8%；在60℃保温1h后，剩余的相对酶活力为54.2%；在70℃保温1h后，剩余的相对酶活力仅为14.6%。说明该重组异甘露聚糖酶的耐热性和热稳定性一般。如图3-C和3-D所示重组异甘露聚糖酶最适pH为6.0，将其酶活定义为最高酶活，且在pH4.5～7.5之间经2h处理后，与最高酶活相比较仍然保存70%左右的相对酶活力，属于偏酸性酶。由表3可以看出，重组异甘露聚糖酶是金属酶，Al3+和Ba2+对酶活力有着较大的激活作用，当存在1mmol/L的Al3+存在时，酶活力提高了2.6倍，Ca2+，Zn2+，K+，Mg2+，Fe3+存在时对酶活力有着激活作用，而Ag+，Cu2+，Mn2+等离子对酶活力有抑制作用。以不同浓度槐豆胶为底物测量重组酶的反应速度，根据图4求出最大反应速度Vmax=1.3U/mg，米氏常数Km=7.3mg/mL。

图3 温度和pH对异甘露聚糖酶的影响Fig.3 Effect of temperature and pH on the isomannanase activity

图4 异甘露聚糖酶作用酵母细胞壁的Lineweaver-Burk图Fig.4 Lineweaver-Burk plot of isomannanase activity against yeast cell wall

3 结论

甘露寡糖作为有益菌的增殖因子，能优化动物胃肠道微生态环境[12]，降低胃肠道疾病[13]；还能够吸附真菌毒素[14]，减少抗生素等化学药物的使用，是生产绿色动物食品一种良好的添加剂。本研究成功克隆并表达了枯草芽孢杆菌K-6中的异甘露聚糖酶基因，为构建基因工程菌生产异甘露聚糖酶奠定了基础。通过诱导表达条件的优化得知，重组菌经32℃，0.6mmol/L IPTG诱导4h后甘露聚糖酶活力最高可达到415.9U/mL与原始菌株比较相对提高了2.02倍。重组异甘露聚糖酶的最适温度为55℃，最适pH为6.0，重组酶在Al3+和Ba2+的存在下酶活及其稳定性都有提高，从这点可以得出异甘露聚糖重组酶是金属酶[15]。

美国Chem Gen公司开发的甘露聚糖酶产品是国际市场上应用最广泛的饲用酶制剂之一，也是目前世界上用于玉米-豆粕型日粮的销售量最大的酶制剂，该酶主要用于以植物甘露聚糖为原料的甘露寡糖制备，本文制备的异甘露聚糖酶是以酵母细胞壁中异甘露聚糖为原料来制备甘露寡糖，从而为甘露寡糖的制备提供了种新途径。本研究在测定酶活力时存在不足之处，因为没有制备得到相对较纯的酵母甘露聚糖，所以使用槐豆胶替代酵母甘露寡糖作为底物来测定酶活力，这一方法还有待进行改善，下一步将对制备高纯度的酵母甘露聚糖进行研究，从而为甘露寡糖的制备提供更科学可靠的理论依据。

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表3 金属离子对酶活的影响Table 3 Effect of metal ions on recombinant isomannanase activity

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Cloning and expression of isomannanase gene and characterization of the enzyme

WANG Li-ping1，*，MU Zhao-yan1，ZHANG Da-bing2，ZHAO Yong1，LENG Xiang-jun1
（1.School of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.School of Life and Technology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China）

Q789

A

1002-0306（2012）16-0213-05

2011-11-18

穆昭艳（1986-），女，硕士研究生，研究方向：食品微生物。

上海市教育委员会项目（07ZZ137）；上海市教育委员会重点学科建设项目（J50704）。