Escherichia coli K5胞外多糖硫酸酯衍生物的制备及其体外抗氧化活性研究

王 华，徐静静，曹 凤，陈敬华

（江南大学医药学院，江苏无锡 214122）

Escherichia coli K5胞外多糖硫酸酯衍生物的制备及其体外抗氧化活性研究

王 华，徐静静，曹 凤，陈敬华*

（江南大学医药学院，江苏无锡 214122）

对Escherichia coli K5菌株进行发酵培养，发酵液上清经超滤、醇沉、Sevage法脱蛋白、透析冻干，再经DEAE琼脂糖柱、G75葡聚糖柱分离纯化后得到K5多糖（K5）。以三氧化硫吡啶为硫酸酯化剂，对K5多糖N位进行了硫酸酯化，制备了K5多糖的硫酸酯衍生物（NS-K5），二糖分析结果显示，N位硫酸酯化率达到57%。并对硫酸酯化前后的K5多糖的抗氧化性能进行了研究，结果显示，一定浓度范围内，NS-K5多糖还原力较K5高，当K5和NS-K5浓度达到1mg/mL时，对羟基自由基的清除率分别达到17.7%、25.6%，对DPPH自由基的清除率分别达到26.1%、45%。实验结果表明，NS-K5的抗氧化活性要高于K5。

大肠杆菌K5，胞外多糖，硫酸酯，抗氧化活性

Abstract：Escherichia coli K5 strain was cultivated by fermentation，the supernatant was treated by ultrafiltration，exopolysaccharide（EPS） was extracted by ethanol precipitation，and then purified by Sevage method，dialysis，freeze-dried，DEAE-Sepharose and Sephadex G-75 column，finally high-purity K5 polysaccharide（K5） was obtained.N site of the K5 polysaccharide was chemically sulfated by Sulfur trioxide pyridine complex，NS-K5 polysaccharide（NS-K5） was prepared，and disaccharide analysis revealed that N-sulfation rate was up to 57%.The antioxidant capacity of K5 polysaccharideand N-sulfated K5 polysaccharide was investigated，the results showed that：within a certain concentration range，the reducing activity of NS-K5 was powerful over K5，when the concentration of K5 and NS-K5 was up to 1mg/mL，the hydroxyl radical scavenging rates were 17.7% ，25.6% ，and DPPH radical scavenging rates were 26.1% ，45% ，respectively.The result indicated that NS-K5 showed stronger antioxidant activity than K5.

Key words：Escherichia coli K5；exopolysaccharide；sulfation；antioxidation

自由基的产生与机体的许多疾病和功能障碍，如肿瘤、炎症、衰老等具有非常密切的关系[1-3]，随着医学及生物学的日趋深入发展，对自由基复杂致病机理的研究成为重要的研究课题之一[4]。作为清除自由基的重要物质——抗氧化剂，在食品工业和医疗健康领域的应用由来已久[5]。目前使用的大多为化学合成类抗氧化剂，由于其存在着安全性问题，已经被一些国家禁用或限制使用，人们对于天然来源，低毒甚至无毒的抗氧化剂的需求不断增加，因此研究开发天然抗氧化剂具有重要的意义。多糖具有抗衰老、免疫调节、抗肿瘤和抗氧化等重要的功能[6]，近年来研究者对天然多糖的抗氧化作用开展了较多的研究[7-8]，不少研究者还对天然多糖进行了硫酸酯化修饰，并对其抗氧化、抗肿瘤、抗菌等生理活性进行了深入的研究，发现其活性与硫酸酯化后的荷电性及分子量密切相关[9-12]。其中微生物来源多糖因为具有易于分离纯化、产量高、成本低等众多优点而受到研究者越来越多的重视[13-15]，但目前国内对于微生物来源多糖及其衍生物的抗氧化研究报道较少。本实验对Escherichia coli K5菌株进行发酵培养，对其胞外多糖K5进行了N位硫酸化，制备了K5多糖的硫酸酯衍生物，并对其进行了体外抗氧化活性研究，以期为细菌胞外多糖的改性及其食品、药品功能化的研究开发提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本实验菌种大肠杆菌E.coli Bi 8337/41（O10：K5：H4） 购自ATCC；无水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、铁氰化钾、硫酸亚铁、溴化钾、水杨酸、三氯乙酸、三氯化铁、双氧水等 均为国产分析纯，国药集团化学试剂有限公司；HeparanaseⅠ、Ⅱ、Ⅲ 苏州国镝医药科技有限公司；1-二甲基-2-三硝基苯肼（DPPH）、抗坏血酸（VC） 为色谱纯，Sigma公司。

红外光谱仪NICOLET NEXUS 470 Thermo Electron Corporation；UV-1800紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；FreeZone2.5L冷冻干燥机 美国Labconco有限公司；恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；日立高速微量离心机CF15RXII 日本日立仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大肠杆菌K5多糖的制备 将大肠杆菌K5菌液接种于10L LB培养基中，转速为600r/min，pH7.4，37℃培养18h。发酵液8000r/min离心10min分离菌体和上清。发酵液上清经分子量10ku截留的超滤仪超滤浓缩，将浓缩液无水乙醇沉淀，无水乙醇终浓度为80%，4℃静置过夜，6000r/min离心10min，收集沉淀，去离子水复溶，采用Sevage法脱蛋白，处理12～15次，醇沉，去离子水复溶，透析冻干即为K5粗多糖。经DEAE琼脂糖柱、G75葡聚糖凝胶柱纯化后，透析冻干即得K5多糖，纯度为95%。

1.2.2 N位硫酸化K5多糖的制备[16]将K5多糖溶解于2mol/L NaOH中，60℃脱乙酰反应18h，反应结束后冷却至室温，用6mol/L HCL调节pH至中性，透析冻干即为N位脱乙酰化的K5多糖。将N位脱乙酰化的K5多糖溶于去离子水，于40℃分四次加入硫酸化试剂三氧化硫吡啶（总投料比为N位脱乙酰化K5多糖∶三氧化硫吡啶=1∶2），间隔为1h，每次加完后用4mol/L NaOH调节pH至9.5，反应36h后，调节pH至中性，透析冻干后即得N位硫酸化的K5多糖。

1.2.3 K5多糖及N位硫酸化K5多糖的结构表征

1.2.3.1 K5多糖及N位硫酸化K5多糖的红外光谱分析 取1mg干燥样品与150mg溴化钾混合研磨压片后，在4000～400cm-1范围内进行扫描测定。

1.2.3.2 K5多糖及N位硫酸化K5多糖的二糖分析 去离子水配制浓度为20mg/mL的样品溶液，取40μL样品溶液，加入pH7.0乙酸钠缓冲液140μL及酶混合液（HeparanaseⅠ、Ⅱ、Ⅲ，1∶1∶1）100μL，混匀后于25℃水浴中酶解48h。HPLC分析反应液，记录峰响应值。

1.2.4 K5多糖及N位硫酸化K5多糖的抗氧化活性测定

1.2.4.1 清除羟基自由基（·OH）活性的测定[17]用去离子水将各多糖样品配制成不同的浓度梯度，以VC为对照进行实验。向1mL样品溶液中加入6mmol/L的FeSO4溶液1mL，混匀后加入6mmol/L的H2O2溶液1mL，混匀后静置10min，最后加入6mmol/L的水杨酸溶液1mL，混匀后于37℃水浴中孵育30min，离心（3000r/min，10min），以去离子水为参比，取上清在510nm处测定吸光值。

羟基自由基清除率计算公式为：

式中：E为清除率；Ao为空白对照；AX为样品溶液的吸光值；AXo为无显色剂时样品溶液的吸光值。

1.2.4.2 还原能力的测定[18]用去离子水将各多糖样品配制成不同的浓度梯度。向2.5mL磷酸盐缓冲液中加入1mL样品溶液，再加入2.5mL 1%铁氰化钾溶液，混匀后于50℃水浴20min，再加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，离心（3000r/min，10min），取上清液2.5mL，加入2.5mL去离子水及0.5mL 0.1%的FeCl3溶液。以去离子水为参比，取上清液在700nm处测定吸光值。

1.2.4.3 清除DPPH·活性的测定[19]用去离子水将各多糖样品配制成不同的浓度梯度，以VC为对照进行实验。用无水乙醇配制浓度为0.04mg/mL的DPPH溶液，向2mL DPPH溶液中加入2mL样品溶液，混匀，静置30min，离心（3000r/min，10min），取上清液于517nm处测定吸光值。

DPPH自由基清除率计算公式为：

式中：E（DPPH·）：样品对DPPH·的清除率；Ao：2mL DPPH·溶液+2mL去离子水混匀测定的吸光值；Ai：2mL DPPH·溶液+2mL样品溶液混匀测定的吸光值；Aj：2mL无水乙醇+2mL样品溶液混匀测定的吸光值。

2 结果与讨论

2.1 红外光谱的分析

图1 K5多糖及NS-K5多糖的红外图谱Fig.1 IR spectra of K5 and NS-K5 polysaccharide

K5多糖是一种N位乙酰化的多聚糖胺聚糖，如图1所示，K5多糖及其硫酸酯衍生物红外图谱表现出多糖化合物的特征吸收峰为3418cm-1处的吸收峰是O-H的伸缩振动；2920cm-1处的吸收峰是C-H伸缩振动；1630cm-1处的吸收峰是C=O伸缩振动；1043cm-1处的吸收峰是环内醚C-O-C振动；硫酸酯化后的K5多糖，在1229cm-1处增加了较弱的S=O伸缩振动吸收峰；在801cm-1处增加了较为明显的N-O-S拉伸振动。通过红外光谱图可以看出，通过以上方法成功的在K5多糖N位引入硫酸基。

2.2 二糖组成分析

K5多糖的结构由己糖醛酸-N乙酰氨基葡萄糖的重复单元组成，而NS-K5多糖由己糖醛酸-N硫酸氨基葡萄糖及己糖醛酸-N乙酰氨基葡萄糖的单元组成，本实验采用特异酶解样品多糖，能够深入分析样品N位硫酸化的状况。样品二糖分析结果如图2和表1所示。

从表1中可以看出，K5多糖的双糖分析结果显示较为均一，△UA-GlcNAc双糖含量达到98.24%。NSK5多糖的二糖分析结果显示，△UA-GlcNAc双糖含量仅为11.99%，硫酸酯化修饰过后的△UA-GlcNS双糖含量达到57%。

图2 K5多糖及NS-K5多糖的二糖分析图谱Fig.2 Disaccharide analysis spectra of K5 and NS-K5 polysaccharide

表1 样品中二糖组成及其含量Table 1 Disaccharide composition and content of samples

2.3 抗氧化分析

2.3.1 清除羟基自由基（·OH）活性 H2O2和Fe2+混合发生Fenton反应，生成具有很高反应活性的·OH，其能被水杨酸有效的捕获，并生成2，3-二羟基苯甲酸，该羟基化合物在510nm处有特异性吸收，假若在反应体系中加入具有清除作用的活性物质，便会与水杨酸竞争性捕捉·OH，从而使得有色物质生成减少。

图3 K5、NS-K5多糖及VC对羟基自由基的清除能力的比较Fig.3 Comparison of hydroxyl radical scavenging capacity of K5，NS-K5 polysaccharide and VC

从图3可以看出，随着样品浓度的增加，K5及NSK5多糖对羟基自由基的清除能力在0.05～0.5mg/mL区间内逐步增强，当浓度大于0.5mg/mL时，清除能力随着样品浓度的升高逐渐呈现平稳趋势。NS-K5多糖较K5多糖清除羟基自由基的能力强，较VC弱，当浓度达到1mg/mL时，K5多糖及NS-K5多糖的清除能力分别达到17.7%、25.6%。

2.3.2 还原能力的测定 抗氧化剂是一类能帮助捕获并中和自由基，从而去除自由基对机体损害的一类物质，还原能力越强，抗氧化性越强。多糖还原能力的大小一定程度上反映了多糖抗氧化性能的强弱。本实验中，样品吸光值越高，多糖还原能力越强。

图4 K5、NS-K5多糖还原能力的比较Fig.4 Comparison of reducing power of K5 and NS-K5 polysaccharide

从图4可以看出，随着多糖浓度的增高，反应后样品溶液吸光值稳步增高，说明还原力不断增高，上升趋势明显，当多糖浓度为1mg/mL时，K5多糖的吸光值仅为0.051；NS-K5多糖的吸光值为0.12，结果表明NS-K5多糖较K5多糖还原能力强。

2.3.3 清除DPPH·活性的测定 DPPH·是一种很稳定的氮中心的自由基，该法被广泛用于测定生物试样的抗氧化能力，其乙醇溶液呈现紫红色，在517nm处有最大吸光值。抗氧化剂能够给自由基提供氢原子和单电子而使其褪色，其褪色的程度与抗氧化剂的抗氧化能力成定量关系，试样吸光度越低，样品对DPPH自由基的清除率越高，该样品的抗氧化能力越强。

图5 K5、NS-K5多糖及VC对DPPH自由基清除能力的比较Fig.5 Comparison of DPPH radical scavenging capacity of K5，NS-K5 polysaccharide and VC

从图5可以看出，K5、NS-K5多糖及VC都对DPPH自由基呈现出不同程度的清除作用，随着多糖浓度的增大，其清除作用稳步增高，其中VC的清除作用最强，NS-K5多糖次之，K5多糖对DPPH自由基的清除作用较弱。当多糖浓度低于0.2mg/mL时，K5多糖对DPPH自由基的清除活性比NS-K5多糖略高，但随着多糖浓度的增大，NS-K5多糖显示出更强的清除活性，当浓度增加到1mg/mL时，NS-K5多糖对DPPH自由基的清除率达到45%，远高于K5多糖的清除率26.1%。上述结果表明，NS-K5多糖在一定浓度范围内对DPPH自由基的清除活性高于K5多糖。

3 结论

本实验采用三氧化硫吡啶法成功制备了N位硫酸酯化的K5多糖衍生物，经二糖分析K5多糖N位硫酸酯化程度达到57%。抗氧化实验结果表明，N位硫酸酯化的K5多糖衍生物在一定的浓度范围内对羟基自由基具有一定的清除作用，显示出一定的还原力，对DPPH自由基表现出较好的清除活性，其抗氧化活性比同等浓度下的K5多糖高。

微生物来源多糖作为重要的大分子之一，近年来成为国际研究的热点，其独特的活性和分子特点在药物食品研究开发中蕴藏巨大潜力，对于人类健康具有重要意义。本文旨在为微生物来源多糖的研究及开发提供一定的思路和理论基础。

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Preparation and antioxidant activities of a sulfated derivative of exopolysaccharide from Escherichia coli K5

WANG Hua，XU Jing-jing，CAO Feng，CHEN Jing-hua*
（School of Medicine and Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

TS201.2

A

1002-0306（2012）16-0118-04

2012-03-01 *通讯联系人

王华（1986-），男，硕士研究生，研究方向：多糖生物学研究。

国家自然科学基金（50873080）；教育部新世纪优秀人才计划（NCET-10-0435）。