新生隐球菌总RNA抽提方法的实验研究

徐赤宇 刘翠杰 吴建华 仇芸 赵瑾 朱红梅 温海

(1.济南军区总院皮肤科，济南 250031;2.第二军医大学附属长海医院皮肤科，上海 200433;3.第二军医大学附属长征医院皮肤科，上海 200003)

新生隐球菌 (C.neoformans)是具有荚膜的担子类酵母菌，首先通过呼吸道进入肺部，当宿主免疫力低下时播散入血，最终导致隐球菌性脑膜炎或脑膜脑炎，有很高的死亡率［1］。近些年来基因技术的广泛应用，使新生隐球菌的致病机理的研究达到了一个更新更深的层次，而基因技术的关键是分离到纯净、完整的高质量生物RNA，对于进行相关的致病性基因表达分析研究致关重要［2］。新生隐球菌具有一般真菌所具有的细胞壁以外，还有一般真菌所不具有的厚荚膜，厚荚膜具有防御和抵抗吞噬的特性，通常占整个菌体细胞体积的70%［3］。

常规提取核糖核酸的方法是用酶消化细胞壁和荚膜形成原生质体后再破壁抽提，而这个过程往往比较繁琐;在所有的RNA实验中，实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNase)的污染和RNA的降解。目前常用的破壁方法包括:热酸性酚裂解法破壁酶、液氮破壁、酸洗玻璃珠破壁和微波破壁方法［4］以及异硫氰酸胍联合玻璃珠法快速抽提DAN和RNA［5］等。因为考虑到酶与细胞孵育影响RNA的质量，热酸性酚裂解法RNA提取率低以及微波破壁致大量RNA分子断裂等特点［6-8］，本实验设计了4种RNA提取方法进行对照试验，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株来源 新生隐球菌H99(由美国NIH KwonChung教授惠赠);新生隐球菌Cap60无荚膜突变株 (美国 McGurire Veterans Administration Medical Center，Richmonel，Virginia 23249 的 ES.Jacobson教授惠赠)。

仪器和试剂 ULTROSPEC2100型紫外可见光分光光度仪 (美国 Biochrom Ltd公司);Gel DOC2000凝胶成像分析系统 (美国BD RAD公司);U-3000 Spectrophometer(日本岛津公司);Perkoin-Elmer Cetus9600 thermal Cycler(美国 PE公司);TES溶液，含 10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、5%SDS(pH7.5);溶液 D(4 mol/L异硫氰酸胍、25 mmol/L柠檬酸钠、0.5%Sarcosyl、0.1 mol/Lβ-巯基乙醇);0.45 ～ 0.55 mmol/L Glass beads，Dithiothreitol(DTT)(Singa 公司);RNA 缓冲液，含 10 mmol/L NaCl、200 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、pH7.5;YPD 培养基(2%蛋白胨，2%葡萄糖，1%酵母抽提物);酸性酚;玻璃珠法抽提缓冲液 (100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，10 mmol/L EDTA pH8.0，5 mmol/L DTT，100 mmol/L NaCl，1%SDS);Yeast RNA kit提取试剂 (OMEGA公司)。RT-PCR kit(TaKaRa);定量PCR检测引物由上海生工合成。罗氏LightCycler 1.5定量PCR仪。

1.2 方法

菌株的培养和裂解 菌株接种到固体沙堡氏培养基斜面上，充分活化3 d后移种一整环菌株于装有100 mLYEPD培养基250 mL三角烧瓶中，30℃振荡培养 (200 r/min)16 h，取1 mL菌液离心收集菌体 (5 000 r/min 5 min)，用双蒸水洗涤2次后重新离心收集菌体 (5 000 r/min 5 min)，每mL菌量约为9×109个。

荚膜菌株和荚膜缺陷株总RNA提取 严格操作规程，防止RNA酶的污染。

酸洗玻璃珠法 1 mL YEPD菌体培养液置于1.5 mL管中，10 000 r/min离心2 min收集菌体;用双蒸水洗涤两次，同法离心，弃上清液;加入RNA缓冲液重悬，加入200 μL的玻璃珠抽提缓冲液，充分混匀，置于37℃摇床孵育10 min;加入等体积的酸洗玻璃珠酸洗玻璃珠200 μL，高速振荡1 min，冰浴30 s，重复5 ～6 次，加入400 μL 不含1%SDS的玻璃珠抽提缓冲液，手摇混匀;12 000 r/min离心2 min，将上清夜转至另一干净的管中;再加入等体积的酚/氯仿，手摇混匀;12 000 r/min离心10 min;取上清再以等体积的氯仿同法离心1次;加入1/10体积的3 mol/L NaAc(pH5.2)和等体积的异戊醇，来回颠倒数次混匀，-20℃放置20 min;室温下12 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀以70%的冷乙醇洗涤3次，风干后加入适量的DEPC水重溶，-20℃贮存。

液氮研磨法 将上述含有9×109菌体细胞的试剂移入-20℃的50 mL瓷研钵中，加入液氮研磨至糊状物后移到新试管中［9］。将破壁后的试剂置于37℃摇床孵育10 min;加入氯仿，在旋涡混合器上高速剧烈振荡2 min。室温静置10 min，使得核酸蛋白复合物充分完全分离;4℃ 13 000 r/min离心10 min，取上层水相到新离心管中加入异丙醇沉淀RNA;75%乙醇洗涤沉淀，干燥;加入20 μL的DEPC处理过去离子水溶解RNA，-80℃贮存。

异硫氰酸胍一步法 参见文献［10］方法抽提总RNA。

冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法 收取到的菌体细胞约9×109，经冰冷的无RNase水重悬离心，弃上清液后各加入200 μL 的直径0.45～0.55 mm玻璃珠抽提缓冲液，充分混匀，置于37℃摇床孵育10 min;加入等体积的酸洗玻璃珠酸洗玻璃珠200 μL，同时加入1 mL Yeast RNA kit提取试剂，加入400 μL不含1%SDS的玻璃珠抽提缓冲液，手摇混匀，在旋涡混合器上高速剧烈振荡2 min。室温静置10 min，使得核酸蛋白复合物充分完全分离;4℃ 13 000 r/min离心10 min，弃上清液。

总RNA定性和定量分析 每种方法重复5次，将上述抽提的RNA经纯化后稀释50倍，RNA的纯度分别用紫外分光光度计测定样品A260/A280比值，根据公式计算RNA浓度 (μg/mL)=A260×50 μg×稀释倍数×样品总体积，RNA总浓度 (μg/9×109)=20×RNA浓度 (μg/μL)。

总RNA的完整性分析 取5 μL RNA加1 μL溴酚兰，加入1.2%琼脂糖凝胶的加样孔中，电压110 mV，电流400 mA，缓冲液1×TAE电泳10～15 min，用凝胶成像系统对RNA进行完整性分析。

统计学分析 用SPSS 13.0软件采用SNK检验进行不同方法之间的两两比较。

2 结 果

2.1 墨汁涂片及培养

每种方法破壁后墨汁涂片检查及培养 镜检时见大量细胞碎片，但是发现少量的未完全破壁的新生隐球菌，培养均未见生长。

2.2 RNA的定性定量结果和结论(见表1)

对4种方法提取的新生隐球菌菌体细胞的RNA浓度进行SNK检验分析发现，酸洗玻璃珠法和液氮研磨法比较的q=2.74(P＞0.05);酸洗玻璃珠法和异硫氰酸胍一步法两组比较的q=6.85(P＜0.01);酸洗玻璃珠法和冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法两组比较的 q=9.65(P＜0.01);液氮研磨法和异硫氰酸胍一步法两组比较的q=4.02(P＜0.05);液氮研磨法和冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法两组比较的q=6.42(P＜0.01);异硫氰酸胍一步法和冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法两组比较的 q=6.37(P＜0.01)。结果表明酸洗玻璃珠法和液氮研磨法提取的RNA量无差别;酸洗玻璃珠法、液氮研磨法和冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法提取RNA量明显优于异硫氰酸胍一步法;冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit方法最佳。

用t检验对用冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法提取的荚膜株和荚膜缺陷株总 RNA浓度(μg/9×109)进行比较，得出P＜0.01，说明用无荚膜株提取RNA产量明显高于有荚膜株，说明厚荚膜对抽提RNA有影响。

2.3RNA完整性分析 (见图1)

A泳道无5SrRAN的条带，B、C、D泳道三条都有，B和C泳道的25S、18S条带亮度比值约为2，而D泳道的25S、18S条带亮度比值约为4，说明酸洗玻璃珠法和液氮研磨法比异硫氰酸胍一步法提取的RNA完整性好，但是冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法提取的RNA比其他3种方法更好。

2.4 RT-PCR后定量PCR鉴定RNA质量

以引物对新生隐球丝氨酸蛋白酶相关基因的一段编码序列，引物由上海生工合成，丝氨酸蛋白酶基因检测引物序列如下:F.＇-AACTCCACCACAAACACCA-3 ＇;R.5 ＇-GGAAAGACTCAGTCCCGTAA-3＇。actin 基因检测引物序列如下:F.5＇-GCCCTTGCTCCTTCTTCTAT-3 ＇;R.5 ＇-GACGATTGAGGGACCAGACT-3＇。反应体积:20 μL;反应条件:95℃5 s;55℃ 10 s;72℃ 15 s;76℃读取荧光值，40个反应循环。结果显示4种方法提取的RNA都可以进行定量PCR检测，取相同量RNA进行定量PCR检测，冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法的Ct值最小(见表1)，说明这种方法提取的RNA完整性最好，定量PCR检测的扩增曲线见图2。

表1 4种提取方法提取RNA的定量PCR检测Tab.1 RT-PCR Detection results in 4 RNA Extraction Methods

3 讨 论

在与致病性微生物例如细菌、病毒及同属真菌担子类酵母菌白念珠菌等分子生物学研究领域相比较，目前对抽提新生隐球菌RNA并对其进行致病性调控基因方面的研究很匮乏。原因之一可能是新生隐球菌单个致病性酵母细胞中所含的RNA的量非常少，加之新生隐球菌具有占有其体积70%的厚壁荚膜和细胞壁的双重屏障作用，给提取RNA带来一定的困难［11］。当前国内外虽然有文献报道提取新生隐球RNA，但是方法较为繁琐和不便捷，RNA提取的关键是破壁，早期的真菌破壁一般采用液氮冷冻研磨，超声破壁或冷冻干燥研磨，由于剧烈的机械损伤，而导致大量的RNA分子断裂［8］。后来有相继发展了传统的热酸性酚裂解法破壁酶、液氮破壁、酸洗玻璃珠破壁和微波破壁方法［12］虽然取得了较好的效果，但是都易出现RNase的污染和 RNAD降解。目前利用 Trizol法［13］或Tripure法提取各类细胞RNA较为流行，可是因为含有裂解液和变性液等成分，以及担子菌类酵母菌细胞壁的特殊结构，提取过程中不能充分破坏细胞壁，提取的总RNA存在不同程度的降解。另外植物组织和真菌组织比动物组织更为复杂，存在有内源RNase降解RNA问题，许多植物和真菌中含有大量杂质如多糖、多酚等，因为这些杂质分子与RNA有一些相似性，可与RNA同时沉淀或者吸附，因此在植物和真菌组织的提取中，需要用一些特别的步骤或者特别的试剂来去除多糖、多酚等杂质的干扰和污染。本课题组总结上述方法的不足，加以改进，首先利用冷酸洗玻璃珠机械振荡充分破坏新生隐球菌双重屏障，破坏细胞壁的二硫酸键获得较高的原生质体，使得RNA全部释放出来，再使用商品化专门针对酵母菌Yeast RNA kit进行常规的物理分离，使得核酸蛋白复合物完全分离，提取步骤简便、快捷，整个反应过程1h内即可完成，提取的RNA产量、纯度、完整性完全可满足高质量分子生物学研究需要。1×109CFU/mL菌体所获RNA量足够做PT-PCR之用;玻璃珠经反复洗涤可以重复利用，亦节省实验经费。在上述几种抽提方法中，对所用菌株均取对数生长期的细胞为宜，菌龄老化的细胞严重影响RNA的得率。

图1 RNA电泳结果:A.异硫氰酸胍一步法，B.酸洗玻璃珠法，C.液氮研磨法，D.冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法 图2 Real-time PCR结果:A.异硫氰酸胍一步法，B.酸洗玻璃珠法，C.液氮研磨法，D.冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法(β-actin组)，E.异硫氰酸胍一步法，F.酸洗玻璃珠法，G.液氮研磨法，H.冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法 (丝氨酸蛋白酶组)Fig.1 RNA Electrophoresis Results:A.Single-step by isothiocyanate guanidine，B.Glass bead method by acid washing，C.Liquid nitrogen grinding，D.Glass bead method by cold acid washing combined with Yeast RNA Kit Fig.2 Results of Real-time PCR:A.Single-step by isothiocyanate guanidine，B.Glass bead method by acid washing，C.Liquid nitrogen grinding，D.Glass bead method by cold acid washing combined with Yeast RNA Kit(Beta-actin group)，E.Single-step by isothiocyanate guanidine，F.Glass bead method by acid washing，G.Liquid nitrogen grinding，H.Glass bead method by cold acid washing combined with Yeast RNA Kit(Serine Protease group)

实验中可以发现破壁提取新生隐球菌RNA的方法以冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法最好，酸洗玻璃珠法和液氮研磨法次之，而异硫氰酸胍一步法很少。说明玻璃珠通过延长破壁振荡时间可以充分提高破坏酵母相真菌细胞壁效率，其操作简便，需时短于其他破壁方法。总之，提取RNA的方法很多，各有优缺点，实验室可以根据实验的目的、要求、实验条件、组织性质和RNA完整性的要求选择破壁和提取方法，根据我们的实验结果，酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法是提取致病性酵母菌新生隐球菌RNA的有效方法，既可以减少样品间交叉污染又可以减少靶RNA丢失。可以适用于大规模、高产量、高质量地抽提隐球菌RNA和用于RTPCR分析之用。

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