小肠结节灌注与尤斯灌流技术在猪肠道功能研究方面的应用

唐宇龙 ，何流琴 ，2，C.M.NYACHOTI，印遇龙

（1．中国科学院亚热带农业生态研究所，中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室，湖南省畜禽健康养殖工程技术中心，农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站，湖南长沙，410125；2.中国科学院研究生院，北京100039；3.Department of Animal Science,University of Manitoba,Winnipeg,Manitoba,Canada.R3T 2N2）

生猪健康养殖关乎国计民生，猪肠道功能的研究对提高营养的利用率、降低氮排放和增强猪的抵抗力具有重要意义[1，2]。目前，研究肠道功能的方法技术有多种，基本分为在体、离体和体内等几种方法。由于猪肠粘膜具有高代谢与绒毛微血管结构的特性，对灌注不敏感，所以本实验室重点介绍在体的小肠灌注技术和离体的尤斯灌流(Ussing chamber)技术在猪肠道功能研究方面的应用。小肠灌注技术是通过建立仔猪的原位模型[3]，在病原菌的感染下研究益生素、益生菌或其他添加剂防治仔猪肠道腹泻的效果。尤斯灌流技术是用微电极检测整个细胞膜离子通道变化的电流信号，反映肠道药物吸收、通透性和分泌情况的变化[4]。因此，本文就这两种技术的操作、应用和研究进展进行综述。

1 小肠灌注和尤斯灌流技术

1.1 小肠灌注技术及小肠灌注手术对肠道感染的应用

1.1.1 小肠灌注技术 为了控制仔猪的肠道腹泻，Nabuurs建立了原位小肠灌注技术[5]，该方法通过检测小肠的净流量和电解质浓度来鉴定不同物质在腹泻上的作用。我们实验室在加拿大Dr.C.M.NYACHOTI的帮助下，把6mg/kg剂量给予盐酸氯氨酮肌肉注射。在15min-30min后，动物处于麻醉状态，迅速用热肥皂水清洗试验动物，然后将试验动物侧位置于手术台上（左侧朝下，右侧朝上），加上呼吸面罩，开始使用气体麻醉。

先用毛剪剃除术部毛发，再用热肥皂水洗出术部皮脂。以碘酊棉球在术部中心位置开始作发散状螺旋涂抹消毒。稍后用75%酒精棉球如上述同样方法脱碘。盖好手术孔巾。手术者事先严格洗手、消毒，穿戴好手术衣帽、手套。等待动物进入麻醉期Ⅲ期2级，方可开始手术。

在腹腔处用手术刀作12cm-15cm的纵向切口，依次钝性分离腹外斜肌、横直肌和腹内斜肌。到底腹膜层后，由手术者和助手用止血钳对夹，提起腹膜，使腹膜与内脏分离。用手术剪将腹膜剪开3cm左右小口，然后术者左手食指与中指探入腹腔内抬起腹膜，手术剪在两指间剪开腹膜，开口大小与皮肤口大小相当。

先找到胃的幽门部，在离幽门部的300cm处用手术线做成标记。线的前一端固定在离幽门部的300cm,另一端顺着小肠取出余下空肠，不要破坏肠系膜。在距幽门300cm处剪取20cm-25cm的空肠，上端插入内径3mm，外径5mm的皮管，皮管上端连接所需要检测样品的玻璃瓶；下端插入内径5mm，外径9mm的皮管，皮管下端连接着玻璃瓶收集由上端流出的液体。在仔猪的空肠部位可以建立十个同样的空肠手术段。

1.1.2 小肠灌注手术对肠道感染的应用 根据在空肠部位建立的空肠手术片段（图1）分成感染组和非感染组，感染组以浓度108 cfu/mL的病原菌灌注在空肠内，感染15min。非感染组灌注PBS作为对照。感染后待测样品用60mL去离子水溶解到所需浓度，同时加入1 g/L的葡萄糖和酪蛋白氨基酸以促进细菌生长。在试验过程中，60mL的待测样品用注射器缓慢的从皮管上端推进到空肠，速度控制在8mL/h。整个试验过程控制在7.5h。试验结果可通过测定流入和流出液体中钠离子和氯离子的浓度来确定样品对渗透压影响；测定流出液体的总量来研究样品对净吸收量的作用；鉴定病原菌的浓度判断样品对病原微生物的抑制能力。

图1 小肠灌注技术示意图

1.2 尤斯灌流技术的结构和原理

1.2.1 尤斯灌流技术的结构 尤斯灌流系统主要由灌流室、电路系统、数据采集系统以及配套系统组成。常见的灌流室有2、4、6和8室4种类型[6]。根据工艺不同，又分为循环式和持续式，本实验室拥有循环式仪器，如图2。循环式灌流室包括1个U形管道和2个半室，2个半室中间是1个可嵌合组织样本且可移动的插件。持续式灌流室包括2个溶液贮器，通过聚乙烯管道将溶液引入2个半室，并设阀门控制流速。电路系统（图3）包括用于测量跨上皮电压和电流电极、与电压/电流钳相连的导线以及电压/电流钳。电压/电流钳由灵敏的首级信号采集片、电流和流体阻抗补偿范围、用于电导/电阻测量的脉冲发生器、可通过计算机进行仪器控制和数据采集的远程接口以及LED读数显示器组成。

图2 循环式尤斯灌流系统示意图

图3 循环式尤斯灌流电路系统示意图

数据采集系统是一套综合的数据采集与分析软件包，由数据采集硬件、接口电缆及ACQUI R E和ANAL YZE(A&AⅡ)软件包组成。A&AⅡ在Windows环境下运行，可测量电流、电压、电导及阻抗，可同时对1-8个组织进行测量。还包括缩放控制、试验协议、事件标记、数据析取工具及快速数据汇总工具等其他功能。

配套系统包括恒温水浴箱、5%CO2+95%O2混合气体循环系统和注射器等。恒温水浴箱的技术参数：功耗为1 kW，水泵流速为6L/min，恒温波动小于0.5℃。

1.2.2 尤斯灌流技术的基本原理 尤斯灌流系统的基本功能是进行上皮细胞膜离子泵功能和抗渗阻抗测定。上皮组织由密集排列的上皮细胞和少量细胞间质组成，具有极性和紧密连接这两大区别于其他组织的特征。极性是因为细胞游离面（或顶面）和基底面结构和功能的分布不均造成的；而紧密连接又称闭锁小带，常见于单层柱状上皮和单层立方上皮中，位于相邻细胞间隙的顶端侧面，紧密连接除具机械连接作用外，更重要的是封闭细胞间隙，阻止细胞外的大分子物质经细胞间隙进入组织内。上皮细胞膜上的蛋白质逆着离子浓度梯度将离子从膜的一侧转运向另一侧,转运过程中产生跨膜电势，被称为Vt。产生Vt的前提是上皮细胞膜顶侧和基底侧离子的分布是非均匀的。细胞膜顶侧电势（Va）和基底侧电势（Vb）之差即为Vt。通过对上皮细胞电流钳可完成Vt的测定，这就是通常所说的断路记录，在研究上皮物质的吸收以及分泌机制方面极为有用。

1.2.3 尤斯灌流系统的具体操作步骤 使用尤斯灌流之前首先进行缓冲液、试验用溶液的配制，同时制备好电流电极和电压电极，电极制备过程中注意两点：一是电极制备应在3%琼脂糖溶液冷却之前；二是电极中避免气泡的存在，若有气泡应用注射器回吸。在固定上皮组织和加入缓冲液之前，将尤斯灌流系统各个部件安装好，检测系统是否渗水。接着插入电极，电极电阻会随着时间的变化而变化，进而导致电极电阻的不对称性。因此，试验开始前应检测系统噪声以及补偿电压。目前，多数尤斯灌流系统都能补偿溶液阻抗以及电极电压。然后固定好上皮组织以及加入缓冲液，开始电参数记录。上皮组织由于受机械压迫导致电参数(Vt、Isc和Rt)极不稳定，需要10min-30 min的时间让电参数基线稳定下来。一旦电参数基线稳定下来即可开始目的试验，具体操作程序可参考何流琴等方法[7]。

2 小肠灌注和尤斯灌流室技术在肠道研究中的应用

2.1 小肠灌注技术在肠道研究上的应用

断奶仔猪腹泻是养猪业最主要的危害之一，该病严重危害养猪业的健康发展，让其遭受了巨大的经济损失，控制仔猪腹泻的方法已经从添加抗生素转到研究其新的替代物上，已有的研究主要包括益生元、益生菌、卵黄抗体、天然植物、中草药提取物等[8]。小肠灌注技术的应用将加快该研究的速度，降低其研究的成本和加强对其作用机制研究的深入。

Kiarie在2008年为了验证反丁烯二酸(fumaric acid)、氧化锌(zinc oxide)、卵黄抗体(egg yolk antibodies)和卡巴多司(carbadox)的抗腹泻效果[9]，以小肠灌注技术为基础，以肠毒性大肠杆菌为感染源研究了以上物质在空肠中与病原菌的相互作用。其结果证明了PBS对照组与四种不同的添加剂相比，其净流量更高，电解质损失也更大。推断了四种物质均具有抗腹泻的作用。

四种物质的相互比较显示：净流量最高的为丁烯二酸，其次是氧化锌和卡巴多司，卵黄抗体的效果最佳；电解质的损失情况与净流量结果相似。上述物质也进一步在动物试验中证明了具有抗腹泻和抑制病原菌生长的功能。因此原位小肠灌注技术模型能作为一个评估添加剂的技术平台，研究其抗生素替代物，包括益生元、益生菌、天然植物、卵黄抗体等在抵抗仔猪腹泻中的作用，为生猪健康养殖提供技术支持。

2.2 尤斯灌流技术在研究肠道功能上的应用

利用尤斯灌流技术在动物营养与生理中应用主要集中在胃肠道屏障功能以及胃肠粘膜物质转运方面。而胃肠道功能主要集中在胃肠道上皮通透性、内毒素及细菌移位的途径和机制以及谷氨酰胺(Gln)和益生菌对肠道屏障功能的改善等方面。并且尤斯灌流技术为研究胃肠道物质转运效率提供了快捷且有效的途径，研究主要集中在葡萄糖、氨基酸以及矿物元素等物质的转运方面。而本实验室目前应用尤斯灌流技术主要研究了赖氨酸、葡萄糖、谷氨酸等物质在肠粘膜中的物质转运情况。我们实验室采用16只SD雌性大鼠随机分成两组，一组饲喂玉米醇溶蛋白日粮，一组饲喂常规日粮作为对照组。21d后采取大鼠空肠和回肠黏膜，应用尤斯灌流技术测定赖氨酸的肠道通透转运效率。其中试验中为了提高准确性，以甘露醇作为空白对照。当添加1m l含10000μg的Ly s溶液于扩散池，转运60mi n后，试验组与对照组比较，空肠和回肠扩散池内Lys含量变化差异极显著（P=0.003和P=0.001），而接收室内Ly s含量变化差异不显著（P＞0.05）。同时与对照组相比，试验组扩散池内空肠和回肠Lys含量分别低13.60%和15.29%，尽管接收室内Lys含量未受影响，但试验组中L y s由扩散池经空肠或回肠向接收室的转运过程中所消耗的Lys有显著变化(P=0.006或P=0.001)，分别使Lys消耗量增加28.06%或51.74%。试验组空肠和回肠Lys损耗率分别为46.55%和51.28%，而对照组空肠和回肠Lys损耗率分别为36.34%和33.79%。由此可表明在不同日粮间对肠粘膜Lys透过量有显著影响。同时何流琴等研究[7]还发现日粮缺乏Lys对肠道其他AA通透量也有影响。在转运液中除Lys出现在尤斯灌流系统的扩散池和接收室以外，还发现在扩散池和接收室内均测出一些其他AA，即 Arg、His、Thr、Asp、Glu、Ser和 Gly，并且其在空肠和回肠中个别氨基酸有升高或者降低的趋势。但是目前日粮缺乏Lys对其他氨基酸影响机制仍有待进一步研究。并且由于尤斯灌流技术在我国营养学领域研究甚少，技术分析不成熟，其技术原理仍需进一步探讨。

另外本研究组伍力、何流琴[7]等人运用尤斯灌流技术研究了功能性氨基酸对呕吐毒素应激造成的肠道损伤的缓解作用。该实验采用了五种不同日粮饲喂动物，对照组饲喂普通日粮，攻毒组仔猪日粮中添加了6ppm的呕吐毒素，剩余三组仔猪的日粮中分别添加了1%Arg，1%Gln以及精氨酸和谷氨酰胺各0.5%。三个功能性氨基酸组的仔猪提前进行了免疫强化三周后再进行攻毒，经尤斯灌流技术测定其肠粘膜转运葡萄糖和果糖的转运效率。以考察功能性氨基酸对呕吐毒素应激的缓解作用。实验结果表明呕吐毒素显著抑制了葡萄糖和果糖的转运效率，而功能性氨基酸在一定程度上能够缓解呕吐毒素对葡萄糖和果糖的转运效率

3 小肠灌注和尤斯灌流技术在其他方面的应用

3.1 小肠灌注技术对宿主和益生菌的应用

小肠灌注技术除了研究小肠对腹泻的生理反应之外，还可以通过提取小肠粘膜样本研究宿主基因组的转录组学，分析了相关上调的基因。在益生菌的研究方向，Gross[10]通过小肠灌注技术研究了胚牙乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的亲本菌株和Mannose-specific adhesin突变菌株对小肠粘膜的粘附和富集影响，在8h的作用下，胚牙乳杆菌Mannose-specific adhesin基因的缺失将会部分失去对肠上皮细胞粘附和富集的能力，导致在感染情况下该净流量的提高，腹泻几率的上升。因此以小肠灌注技术为基础的试验可证明益生菌相关基因的功能，这将会为研究益生菌的改造从而提供机体抵抗力提供重要的理论基础。

由此可知，原位的小肠灌注技术模型不但能快速评估和研究不同抗生素替代品对抵抗腹泻的作用，而且对于宿主抵抗腹泻机制的研究和益生菌改造提供重要的技术支持。

3.2 尤斯灌流技术在其他方面的应用

利用尤斯灌流系统研究肠道营养物质吸收和代谢的基础主要是根据营养物质可以在肠段特定的位置吸收和通过，测定该特定肠段的营养物质含量，通过有效渗透系数来评价该药物吸收的动力学变化。尤斯灌流技术已经在畜禽营养与药物生理学研究领域逐渐成熟，尤其在胃肠道屏障功能及药物吸收和转运领域得到应用。但关于尤斯灌流很少涉及细胞学研究，特别是对细胞内药物吸收与转运机制的研究。目前药物在肠道内吸收的研究方法有离体、在体、体内等几种方法。据证实Caco-2单层细胞一般认为是药物转运研究的一种合适的体外模型，因为这些单层细胞具有小肠黏膜的大多数酶、功能和形态学特征[11]。但是应用该模型研究药物的吸收情况与体内的差异性较大。而尤斯灌流技术为解决这个问题提供了新思路，为细胞学研究提供了新方法[12]。

尤斯灌流系统的研究对象为上皮组织，而上皮组织广泛分布在身体表面和体内各种囊、管、腔的内表面。上皮组织具有保护、分泌、吸收和排泄等功能，不同部位的不同上皮其功能各有差异。如分布在身体表面的上皮以保护功能为主；体内各管腔面的上皮，除具有保护功能外尚有分泌和吸收等功能；某些上皮组织，从表面生长到深部结缔组织中去，分化成为具有分泌功能的腺上皮。因此，尤斯灌流的研究对象可扩展到机体任意上皮组织。就某一具体上皮组织而言，可研究的内容也多样化，从药物筛选到屏障功能、免疫功能、物质吸收与代谢及分泌和排泄等。

4 小结

小肠灌注和尤斯灌流室技术的应用是相辅相成的，他们主要都是以肠道作为研究对象，研究其益生物质对肠道的营养吸收和抵抗病原侵袭等方面。小肠灌注技术是以原位的活体形式宏观的研究肠道的生理变化；尤斯灌流室技术则是通过离体培养形式研究肠道的微观分子变化。总之这两种技术的应用将为益生物质在肠道的健康上提供重要的技术支持和理论基础。

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