巨噬细胞迁移抑制因子受体CD74与乳腺癌转移及预后的相关性

张大伟 周亮 章勇

（复旦大学附属金山医院普外科，上海 201508）

目前评估乳腺癌患者预后主要根据乳腺癌原发肿瘤大小、局部浸润情况以及腋窝淋巴结是否转移。对乳腺癌细胞转移潜能差异的分子机制的研究有助于探索评估乳腺癌患者预后的分子标志物［1］。生理条件下，CD74主要在抗原递呈细胞表达；除免疫细胞及少数上皮细胞外，其他组织几乎不表达CD74分子。研究［2－3］显示，CD74在B细胞来源的恶性肿瘤以及前列腺癌、胰腺癌等肿瘤中表达显著升高。本研究通过检测不同转移潜能的乳腺癌细胞株及乳腺癌患者手术后石蜡组织标本中CD74的表达情况，探讨CD74与乳腺癌患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 89例乳腺癌组织取自2007年1月—2009年1月复旦大学附属金山医院普外科手术切除标本，均经病理学明确诊断。89例乳腺癌患者均为女性；根据患者整体情况选择放、化疗和内分泌治疗。89例患者根据一般资料及相关病理资料如年龄（≤49岁和＞49岁）、有无肿瘤家族史、肿瘤直径（＞5 cm和≤5 cm）、病理学类型（浸润性导管癌和其他病理学类型）、肿瘤分化（Ⅰ～Ⅱ级和Ⅲ级）及有无淋巴结转移分组。术后第1年每3个月随访1次，第2年每6个月随访1次，第3年后每年随访1次，随访截止日期为2011年3月31日或至患者病死。预后评价指标包括无瘤生存率和总生存率。无瘤生存率按手术日期至发现第1次肿瘤复发或转移事件日期进行计算，总生存率按手术日期至肿瘤相关性病死日期进行计算。

1.2 乳腺癌细胞株中CD74 mRNA及蛋白表达的检测 抽提 MCF－7和 MDA－MB－231中RNA，将其逆转录为cDNA，同时提取总蛋白。应用荧光定量聚合酶链式反应（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ－PCR）检测细胞株中 CD74 mRNA表达量。用蛋白质印迹（Western blotting）方法检测细胞系中CD74蛋白表达量。

1.3 乳腺癌组织中CD74分子表达的检测 手术切除的标本经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋、4μm连续切片，分别进行HE和免疫组织化学染色。免疫组织化学SP法按SP试剂盒说明进行操作，一抗为兔抗人CD74多克隆抗体，采用柠檬酸缓冲液微波修复，3，3－二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染，脱水、透明、固定。用磷酸盐缓冲液代替一抗作为空白对照，用非免疫血清代替一抗作阴性对照。应用英国剑桥大学计算机成像系统（Leica Microsystems Imaging Solutions，Ltd）采集阳性染色图像（×200）。CD74阳性着色为棕色。采用QWin Plus v3软件判定4个代表性视野的平均累计光密度，以中位数为界值，≥中位数者为阳性表达，＜中位数者为阴性表达。

1.4 乳腺癌组织学分级和临床分期标准 组织学分级参照中国抗癌协会编写的《新编常见恶性肿瘤诊治规范》。临床分期参照2002年美国癌症委员会（第6版）标准。

1.5 统计学处理 采用SPSS 15.0软件进行统计学分析。不同细胞株CD74表达分析用χ2检验，病例随访资料采用Kaplan－Meier法进行生存分析并得出Log－rank分析结果，预后因素采用Cox回归模型分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 乳腺癌细胞株MCF－7 和 MDA－MB－231 中CD74 mRNA和蛋白表达 在低转移潜能乳腺癌细胞株MCF－7中CD74表达量低，其中mRNA相对表达量（2－ΔCT，ΔCT＝目的基因 CT 值－TBP CT值，TBP为内参基因）为（0.0032±0.0007）；在高转移潜能乳腺癌细胞系 MDA－MB－231中CD74表达量较高，其中 mRNA相对表达量为（12.85±0.79）。MCF－7和 MDA－MB－231中CD74 mRNA表达水平有显著差异（P＜0.001），见图1A。MCF－7 和MDA－MB－231中蛋白水平相对检测灰度（蛋白／βactin）有显著差异（P＝0.009），见图1B。

2.2 乳腺癌组织中CD74的表达情况 89例乳腺癌组织中44例（49.5%）CD74阴性表达，肿瘤细胞未见阳性染色，见图2A；CD74阳性表达45例（50.5%），阳性染色定位于肿瘤细胞及部分淋巴细胞、成纤维细胞胞浆中，棕色深染，见图2B。

图1 A为FQ－PCR方法检测乳腺癌细胞系MCF－7和MDA－MB－231中CD74mRNA表达；B为Western Blotting方法检测乳腺癌细胞株MCF－7和MDA－MB－231的CD74蛋白表达及表达量的比较

图2 CD74在人乳腺癌组织的表达（×200，DAB染色）

2.3 Kaplan－Meier分析 CD74阴性表达乳腺癌患者总生存率显著高于阳性表达乳腺癌患者，见图3。CD74阴性表达乳腺癌患者无瘤生存率显著高于CD74阳性表达乳腺癌患者，CD74阴性表达乳腺癌患者肿瘤转移复发发生率显著低于CD74阳性表达乳腺癌患者，见图4。

2.4 乳腺癌患者总生存率与无瘤生存率预测因素单因素Cox比例风险回归模型分析显示，与乳腺癌患者总生存率相关的因素有肿瘤直径＞5 cm、有淋巴结转移、乳腺癌组织CD74高表达，其风险比（hazard ratio，HR）与95%可信区间（confidence interval，CI）依次为0.348（0.120～1.012）、0.350（0.140～0.875）、6.925（2.385～20.110）；影响无瘤生存率的因素有肿瘤直径大于5 cm、肿瘤病理类型为浸润性导管癌、有淋巴结转移以及乳腺癌组织CD74高表达，其 HR（95%CI）依次为0.443（0.213～0.918）、1.642（1.137～2.180）、0.527（0.285～0.976）和3.605（1.920～6.766）。

图3 CD74表达对总生存率影响的比较

图4 CD74表达对无瘤生存率影响的比较

多因素Cox比例风险模型分析显示，在校正了年龄、肿瘤直径、淋巴结转移、病理学类型后，乳腺癌组织CD74高表达是患者总生存率与无瘤生存的独立预测因素，其 HR （95%CI）依次为6.156（2.099～18.057）和3.555（1.860～6.792）。

3 讨 论

目前关于CD74参与肿瘤发生、发展的分子学机制的研究尚处于初始阶段。Kaufinan等［4］应用人化抗CD74抗体HLL1处理荷B细胞瘤的裸鼠后，其肿瘤的生长明显受抑。作为巨噬细胞迁移抑制因子（migration inhibitory factor，MIF）的受体，CD74与MIF结合后启动细胞下游信号级联反应，促进细胞生存；CD74也可激活核因子－κB（nuclear factor－kappa B，NF－κB），促进细胞增殖。透明质酸受体CD44是CD74受体复合体的必要组成部分，在MIF与CD74结合过程中透明质酸结合域起到重要作用，从而影响肿瘤的MIF信号传导，CD44已被证实与乳腺癌的发生密切相关［5］。

由于CD74分子具有阻断MHC－II类分子与内源性免疫抗原肽结合的特性，而肿瘤细胞抗原作为潜在内源性抗原分子，当CD74过度表达时，会降低肿瘤细胞的免疫原性，使肿瘤细胞脱离机体免疫监视功能得以存活。同时，MIF对肿瘤抑制基因p53具有负调控作用；MIF与CD74分子结合后，降低了p53分子的磷酸化水平，导致细胞周期进展及凋亡减少。McClelland等［6］对非小细胞肺癌研究发现CD74与MIF共表达，MIF／CD74复合物增加了促血管新生的CXC趋化因子的分泌及肿瘤的血管密度。CD74分子可能通过参与调控血管生成相关因子的表达来促进肿瘤的发生发展。

本研究显示，乳腺癌高转移潜能细胞株MDAMB－231中 CD74高表达，而低转移潜能细胞株MCF－7 CD74表达量较低，说明CD74在肿瘤细胞的转移过程中扮演重要角色。CD74是乳腺癌患者无瘤生存率及总生存率的独立预测因子，高表达CD74可以用来评估乳腺癌肿瘤进展或不良预后，指导乳腺癌患者的个体化治疗。

［1］ 谢立平，张彧婷，刘冰华，等.乳腺癌组织中nm23和P53的表达与浸润转移的相关性研究［J］.中国现代医生，2010，48（6）：20－21.

［2］ Meyer－Siegler KL，Iczkowski KA，Leng L，et al.Inhibition of macrophage migration inhibitory factor or its receptor（CD74）attenuates growth and invasion of DU－145 prostate cancer cells［J］.J Immunol，2006，177（12）：8730－8739.

［3］ Nagata S，Jin YF，Yoshizato K，et al.CD74 is a novel prognostic factor for patients with pancreatic cancer receiving multimodal therapy［J］.Ann Surg Oncol，2009，16（9）：2531－2538.

［4］ Kaufman JL，Niesvizky R，Stadtmauer EA，et al.Dose－escalation trial of milatuzumab （humanized anti－CD74 monoclonal antibody）in multiple myeloma［J］.J Clin Oncol，2009，27（15）：85－93.

［5］ Gore Y，Starlets D，Maharshak N，et al.Macrophage migration inhibitory factor induces B cell survival by activation of a CD74－CD44 receptor complex［J］.J Biol Chem，2008，283（5）：2784－2792.

［6］ McClelland M，Zhao L，Carskadon S，et al.Expression of CD74，the receptor for macrophage migration inhibitory factor，in non－small cell lung cancer［J］.Am J Pathol，2009，174（2）：638－646.