H3N2亚型犬流感病毒重组HA1蛋白间接ELISA检测方法的建立

黄柏槐，张敦伟，远立国，张桂红*，李守军*

（1.华南农业大学兽医学院，广东广州 510642；2.广州医药工业研究院，广东广州 510240）

犬流感（Canine influenza，CI）是由正粘病毒科A型流感病毒属CI病毒（CIV）引起的一种犬属动物接触性呼吸道传染病，患犬主要临床症状为发烧、咳嗽、流鼻涕、食欲减退、精神沉郁等。近年来，国外有报道H3N8、H5N1以及H3N2亚型流感病毒可以跨越品种障碍而感染犬，甚至可以引起犬群中的水平传播[1-3]。我国2006年报道的H3N2亚型CIV，进化分析与禽源流感病毒亲缘关系较近，相似性较高，各基因片段均来源于禽源，具有禽源流感病毒的特征[4-5]；我国2009年报道的H1N1亚型CIV，与当时人群中流行的甲型H1N1流感病毒同源性高达99%[6]。宠物犬作为伴侣动物与人类接触亲密，CIV对人类的健康存在潜在的威胁。因此，监测CIV流行情况显得尤为重要。

血清学监测是流感流行病学调查的常用方法，通常在犬出现临床症状后第7 d可以检测到血清抗体[7]。目前，对CIV检测最常用的是间接血凝抑制（HI）方法，但其样品处理繁琐，并且误差较大。与HI比较，ELISA在敏感性和特异性方面均有明显优势。因此，本实验利用基因工程技术表达流感病毒的表面抗原蛋白，建立一种间接ELISA方法，为H3亚型CIV的检测提供一种良好的技术手段。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂 CIV H3亚型阴阳性血清、犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）和犬副流感病毒（CPIV）阳性血清均由本实验室制备；H1N1、H1N2、H6N6、H9N2亚型CIV阳性血清由华南农业大学兽医学院禽病教研室提供；HA1蛋白抗原由本实验室纯化保存；Ni-NTA His Bind Resin购自上海生工生物工程技术服务有限公司；预染蛋白Marker购自Fermentas公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记兔抗犬IgG购自JACKSON公司。

1.2 间接ELISA方法的建立

1.2.1 抗原浓度及血清稀释度的确定将浓度为200μg/mL的重组抗原HA1蛋白[8]以包被液分别稀释至 12 μg/mL、10 μg/mL、8 μg/mL、6 μg/mL、4 μg/mL；将阳、阴性血清分别按 1∶10、1∶30、1∶60、1∶100、1∶200比例稀释，建立方阵；将酶标二抗1∶8 000倍稀释，进行ELISA反应，每孔重复3次，选取阳性OD490nm平均值为1.0左右、阴性OD490nm平均值低、P/N比值大的稀释度，以确定抗原包被浓度和阳性血清最适稀释倍数。

1.2.2 封闭液和封闭时间的选择以0.1%BSA，1%BSA，5%脱脂乳各200μL对ELISA板进行封闭，各封闭液重复3孔，进行ELISA试验，选择最适的封闭液。用上述试验得到最佳抗原包被浓度、最佳封闭液、最适的血清稀释度进行间接ELISA试验，分别封闭0.5 h、1 h、1.5 h和2 h，确定最佳封闭时间。

1.2.3 酶标二抗最适稀释倍数的确定将抗原稀释到最适浓度（8μg/mL）后包被反应板，将酶标二抗用稀释液作 1∶5 000、1∶8 000、1∶11 000、1∶14 000 共 4个稀释倍数，以最适一抗稀释度进行ELISA反应，以确酶标二抗最适稀释倍数。

1.2.4 血清与二抗最佳反应时间确定将血清、二抗作最适稀释，血清和二抗的反应分别以30 min、45 min、60 min、75 min共4个时间进行ELISA反应，以确定血清和二抗的最适反应时间。

1.3 判定标准的确定 采用CIV阴性血清样品30份，以建立的间接ELISA方法进行检测，测定OD490nm值后计算样本平均值（X）和标准差（SD）。根据统计学原理，OD490nm值>X+3SD时，可以在99.9%的水平上判定为阳性。

1.4 ELISA特异性试验 按建立的ELISA操作步骤，用H1N1、H1N2、H6N6、H9N2猪流感阳性血清和CDV、CPV、CPIV的阳性血清进行交叉试验，同时设立CIV阳性、阴性血清对照。

1.5 ELISA重复性试验 取5份抗体水平不同的血清进行批内、批间重复性试验，结果进行统计学分析。

1.6 与HI检测方法的比较 用HA1重组蛋白建立的ELISA方法和HI试验同时检测150份现地血清，比较其阳性率和总符合率。

2 结 果

2.1 ELISA方法的建立 通过方阵滴定法确定抗原最佳浓度及血清最佳稀释度[3]。经试验确定重组HA1蛋白包被浓度为8μg/mL，血清稀释度为1∶60，酶标二抗作1∶8 000稀释，1%BSA于37℃封闭1 h，血清和酶标二抗各作用1 h，试验结果最好，P/N值最大并且接近1。

2.2 判定标准的确定 经HI鉴定的CIV阴性血清样品30份，采用已建立的间接ELISA方法检测，经计算[9]X为0.153、SD为0.025。根据统计学原理确定阴阳性血清的临界值（X+3SD）为0.228，当样品OD490nm值≥0.228时判定为阳性；样品OD490nm值<0.228时，判定为阴性。

2.3 特异性试验 按建立的ELISA操作步骤，以H1N1、H1N2、H6N6、H9N2亚 型 SIV及 CDV、CPV、CPIV的阳性血清进行ELISA检测，以CIV阳性、阴性血清作为对照。结果显示H1N1、H1N2、H6N6、H9N2亚型SIV、CDV、CPV、CPIV的阳性血清OD492nm值均小于临界值（表1），表明本研究建立的ELISA方法对CIV的特异性好。

表1 特异性试验Table 1 Specific test（OD492nm）

2.4 重复性试验 按已建立的间接ELISA最佳反应体系进行批内、批间重复性测定，试验所得数值运用M icrosoft Excel中相应函数计算X和SD。运用统计学变异系数公式计算各样品的变异系数（CV）。变异系数=标准差/平均数，即CV%=S/V×100%。批内变异系数在1.06%～7.52%之间，批间变异系数在1.01%～6.71%之间，均小于10%，具有较好的重复性（表2）。

表2 组内、组间重复性试验结果Table 2 Intra-and inter-assay of ELISA reproducibility

2.5 与HI检测方法的比较 采用ELISA和HI同时检测150份现地血清，比较2种检测方法的阳性率及符合率。结果显示所检血清ELISA阳性为8份，阴性为142份；HI阳性为6份，阴性为144份。表明本实验所建立的ELISA方法在灵敏度和特异性方面均高于HI，二者的符合率为98.6%（表3）。

表3 间接ELISA与HI的符合试验Table 3 Consistent test between indirect ELISA and HI

3 讨 论

HA是CIV的表面抗原蛋白之一，具有诱导产生中和抗体的能力。HA经裂解酶可以裂解为HA1和HA2两个亚单位。HA1亚单位为HA的头部，在该部位分布有基因的受体结合位点和抗原决定簇，HA2亚单位主要起到将病毒锚定在囊膜脂质双分子层的作用。文献报道HA1的抗原性远高于HA2[10-11]，因此本实验仅表达HA1部分作为抗原，一方面降低了蛋白表达的难度，另一方面也不会影响到蛋白的抗原性。

本研究通过方阵试验确定以8μg/mL的HA1蛋白包被反应板，待检血清最佳稀释度为1∶60试验效果较好。由于常见的几种犬类传染性病毒（CDV、CPV和CPIV）均含有HA基因，因此本研究采用构建的ELISA方法与CDV、CPV和CPIV进行特异性试验，结果表明未发生交叉反应，可以应用于临床犬类H3N2流感病毒的检测。同时，对H1、H6和H9亚型CIV进行交叉试验，结果表明应用于本研究的HA蛋白抗原不与流感病毒的其他亚型发生交叉反应，表明该方法具有较好的流感亚型特异性。变异系数能够衡量资料中各观测值变异程度，反映各观测值在单位均值上的离散程度。该方法批内、批间重复性试验的变异系数为1.01%～7.52%，变异系数小于10%，表明其重复性较稳定。同时，与HI同时对150份现地血清进行检测，试验表明总符合率达98.6%。ELISA的检出率略高于HI，表明本研究构建的ELISA敏感度良好。

本研究是我国首次报道建立H3N2亚型CIV血清学ELISA检测方法。因此，本实验室将继续对HA1蛋白构建的ELISA方法进行优化，同时利用该方法对我国的犬群进行血清学调查。

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