三七制剂对血管性痴呆大鼠海马神经元 ERK的影响

王丽华,王国辉,金玉玲,秦丽红,王志群

(佳木斯大学附属第一医院神经一科,黑龙江 佳木斯 154003)

随着中国老龄社会化的加快,痴呆是影响老年人生活健康的重要疾病之一[1]。近年来,细胞外信号调节的蛋白激酶(ex tracellular signal regulated protein kinase,ERK)通路在神经元凋亡方面的作用引起了国内外的广泛关注。人参皂苷三七总皂苷是从中药三七中提取的有效活性成分,并精制备成临床应用中药三七提取物制剂,临床应用的机制可能有活血化瘀、通筋活络之功效。本实验通过三七制剂对血管性痴呆大鼠动物模型 ERK的影响,初步探讨三七制剂脑保护方面的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物分组及给药:Wistar雄性大鼠24只,鼠龄3～5个月,体重 300～ 350g,由佳木斯大学实验动物中心提供。动物分组及给药:测试合格后把合格大鼠随机分为正常对照组:不予任何处置;假手术组(除不结扎双侧颈总动脉,余处理同模型组);模型组 (血管性痴呆大鼠动物模型 );治疗组(三七制剂灌胃组);每组6只。

1.1.2 试剂:SP免疫组化试剂盒、兔抗鼠 ERK多克隆抗体、DAB显色试剂盒,均由北京中衫金桥生物技术有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 模型建立:参考黄新武等[2]建立血管性痴呆大鼠动物模型。

1.2.2 制作实验大鼠的脑组织标本。

1.2.3 HE(苏木精-伊红)染色。

1.2.4 免疫组织化学染色。

1.3 统计学方法

采用 SPSS16.0统计软件进行数据分析,所得数据以均数±标准差 (± s)表 示,组间比较采用 t检验,检验水准P＜0.05。

2 结果

2.1 一般行为学观察

手术前各组大鼠各方面活动、饮食、二便正常,毛发有光泽。制作血管性痴呆大鼠模型时,大鼠在颈总动脉结扎后出现短暂肢体抽搐,皮肤温度降低,术后早期大鼠精神状态差、少动、平衡能力差 ,随后出现嗜睡、饮食差、毛发有脱落;对照组变化不明显。模型大鼠在治疗后,活动增加,摄食和饮水渐渐有所恢复。制作各组模型时死亡的大鼠除外,正常对照组6只,假手术组6只,模型组5只,治疗组5只,制作模型死亡率为8.33%。

2.2 各组大鼠海马 CA1区 HE染色结果

假手术组大鼠海马 HE染色观察 CA1区锥体细胞体积完整,排列规则,胞核呈圆形或椭圆形 ,核仁显现明显,染色质质地均匀,细胞数量多,相比较模型组大鼠锥体细胞破碎不完整 ,坏死明显,结构松散,排列紊乱,细胞数量明显减少;治疗组大鼠正常细胞胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰,染色质丰富,排列较密,少见固缩变性的神经元,神经元数量较多。

2.3 各组大鼠海马 CA1区免疫组化海马 ERK结果

痴呆组大鼠海马 CA1区神经元 ERK的表达量与正常对照组和假手术组相比较,有明显降低 (P＜0.01);治疗组大鼠海马 CA1区神经元 ERK的表达量较痴呆组升高,与正常对照组和假手术组相比较显著降低 (P＜0.01)。

表1 各组大鼠海马 CA1区免疫组化 ERK结果

3 讨论

3.1 血管性痴呆模型的建立

相对理想的 VD模型特征有以下几点:(1)动物选择符合模型要求;(2)操作简单,对动物伤害刺激小;(3)要求动物存活时间长;(4)中枢神经元损伤明显;(5)专家公认的实验大鼠行为学指标异常。实验解剖基础源于大鼠脑部血液与人脑组成、血管分布几乎相同,都是由基底动脉环 (Willis环 )进行相互沟通,主要是指左右两侧颈内动脉和椎-基底动脉,四血管入颅后,组成血管交通,脑内的血液相互供应。

国内及国际 VD动物模型的制备尽管较多,但理想的VD模还没有得到一个公认。由 Pulsinelli[3]1979年首创四血管阻断法(4-VO),其方法是阻断全脑供血,对动物伤害大,动物难以存活。两血管阻断法 (2VO法)的经典方法,操作简单,手术线将颈总动脉永久性结扎,由于其操作简单,应用面很广,大量研究应用此法进行动物模型制备,进行相关的实验研究[4～6],但此方法同时结扎双侧颈总动脉,可能牵拉动物迷走神经,动物死亡率也偏高。黄新武[1]等在传统2VO法基础上采用不同时间点分别永久结扎左右颈总动脉,相隔3d间断性永久结扎,此法操作容易,对动物伤害刺激小,动物死亡率低,并有效模拟人脑缺血的慢性过程。本实验采用黄新武等制备模型方法不同时间点分别永久结扎左右颈总动脉即:改良2-VO。

3.2 三七制剂对血管性痴呆大鼠 ERK表达的影响

ERK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen actived protein kinase,M APK)的一个亚类,M APK是细胞内的一类丝氨酸和 (或)苏氨酸蛋白激酶,主要由 c-Jun氨基末端激酶 (CJun N-terminal-kinase,JN K)、 p38和 ERK 3条信 号通路组成,是细胞应激和损伤反应的主要信号通路[7]。有的学者认为 ERK的高度活化可通过调节 c-fos,c-jun形成 fos-jun异源二聚体来调控下游基因,特别是凋亡相关基因的表达,从而参与神经细胞的损害过程,引起细胞凋亡。付度关[8]等试验通过利用光化学法诱导建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,并在尾静脉注射 M EK阻断剂,实验结果表明抑制ERK磷酸化仅能部分抑制细胞凋亡,与假手术组相比较经阻断剂干预的缺血组神经元凋亡率明显升高。而 Alessandrini等[9]在应用另一种 M EK1特异性阻断剂大鼠脑缺血再灌注模型中发现,药物干预组的大鼠与模型组相比梗死面积减少了大半,实验结果认为抑制神经元凋亡是阻断 ERK通路。但多数学者[10]认为,阻断 ERK通路激活可以导致细胞凋亡,相反激活 ERK通路在细胞应激反应中对细胞起到保护作用。本实验在建立可靠的 VD大鼠动物模型后,HE染色观察假手术组大鼠海马 CA1区锥体细胞体积完整,排列规则,胞核呈圆形或椭圆形,核仁显现明显,染色质质地均匀 ,细胞数量多,相比较模型组大鼠锥体细胞破碎不完整,坏死明显,结构松散,排列紊乱,细胞数量明显减少。治疗组可以使该区域脱失的神经元数目明显减少、细胞排列的更加致密且规则。免疫组织化学染色显示:痴呆组 ERK表达量较对照组降低。ERK表达的降低可能参与血管性痴呆的发生发展过程。本实验的结果与大多数学者的结果一致即 ERK对神经元有保护作用。

三七制剂其主要药理作用通过有效成分细胞内钙,钠含量显著降低 ,从而抑制钙离子超载,达到缓解脑水肿程度,起到对缺血再灌注脑损伤保护作用;另一种机制通过非特异性的阻断钙通道,扩张脑血管,增加血流量,改善脑循环作用;抗血小板凝集降低血液黏稠同时具有清除自由基及抗脂质性氧化作用,显著减少脑组织中及血浆中丙二醛,并显著升高超氧化物歧化酶(SOD)活性,SOD对黄嘌呤氧化酶氧化黄嘌呤产生的氧自由基具有清除作用;中药三七提取物制剂能降低脑细胞耗氧量及耗能量,达到保护神经元细胞,起到脑保护减少缺血面积。

本实验为进一步研究三七制剂对血管性痴呆的治疗提供了理论依据。由于本实验研究受实验条件限制,ERK的下游信号通过何种途径产生保护作用仍需进一步研究。

[1]陆晓红,程月红,金玉玲,等.hG-CSF联合 bFGF对缺血性脑卒中鼠神经功能及 CD34,M AP-2表达的影响 [J].黑龙江医药科学,2011,34(4):11-12

[2]黄新武.不同时点分别结扎左、右颈总动脉建立大鼠血管性痴呆模型 [J].中国老年学杂志,2010,7(30):2006-2007

[3]Pulsinelli WA,Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric is-chemia in the unanesthetized rat[J].Stroke,1979,10(3):267

[4]赵宪林,李东培,方秀斌,等.血管性痴呆大鼠海马神经元超微结构的研究 [J].解剖科学进展,2000,6(2):161

[5]范文辉,刘之荣,李露斯.血管性痴呆的动物模型及其胆碱能机制研究 [J].第三军医大学学报,2000,22(4):314

[6]王守春,孙莉,张昱.益智口服液对慢性脑缺血痴呆大鼠学习记忆的影响 [J].现代康复,2001,5(2):53

[7]Gao F,Hu XY,Xie XJ,et al.Heat shock protein 90 protects rat mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis via the PI3K/Akt and ERK1/2pathways[J].J Zhejiang Univ Sci B,2010,11(8):608-617

[8]付度关.ERK对缺血缺氧性脑损伤后神经元凋亡的影响 [J].卒中与神经疾病,2007,14(6):346-349

[9]Alessandrini A,Namura S,Moskowitz M A,et al.M EK1 protein kinase inhibition protects against damage resulting from focal cerebral ischemia[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(22):12866-12869

[10]Ren ZZ,Wu CR,Fujihara H,et al.Both caspase-dependent andcaspase independent path ways may be involved in hippocampal CA1neuronal death bec ause loss of cytochrome C from mitochondria in a rat forebrain ischemia model[J].JCere Blood Flow M eta,2001,21(5):529-540